高表达稳定株的构建.pptVIP

实验的步骤： GDF15基因的提取及PCR扩增 载体质粒的提取(细菌的培养和质粒的提取) 双酶切 连接 转化到细菌（感受态的制备） 双酶切鉴定，基因测序鉴定 扩大培养细菌和重组质粒提取 病毒制备 转染细胞筛选稳定表达GDF15蛋白的细胞 Gdf15基因所在细胞的RNA的提取 反转录cDNA Gdf15基因引物设计（注意要加上酶切位点序列） PCR扩增Gdf15基因 凝胶电泳及PCR产物回收 利用Vector NTI 8.0软件设计NPM1基因序列扩增引物，在引物两端分别加EcoR I、BamH I酶切位点和3个保护碱基 引物名称 序列 , FWD GCGGAATTCATGGAAGACTCGATGGATATGGACATG , REV GCGGGATCCTTAAAGAGATTTCCTCCACTGCCAGAG 下划线标示出限制性酶切位点 / Addgene: pLJM1-EGFP 举例： 1细菌： Stbl3菌株、DH5α菌株 2质粒 pCDNA3.1质粒、pLJM1质粒、V51-S3质粒 甘油菌种（-80度保存）1ml 方法一： 直接取10ul至4ml培养基中，加上相应抗生素，进行培养（37度250 rpm培养12 h左右） 然后做个菌落PCR，如果有目的条带，拿去测序。当然如果以前做过测序的话，就不需要再测啦。 材料： 超净工作台、酒精灯、移液枪、灭菌锅、试管、三角烧瓶、恒温摇床 试剂 LB培养基： Tryptone 10 g/L ， Yeast extract 5 g/L， NaCl 5 g/L（ph7.4-7.6） 抗生素：氨苄、卡那霉素 灭菌接种环 沾取标本 接种划线 37度培养过夜 方法二：平板划线接种法 挑取单克隆 扩大培养 材料： 灭菌锅、三角烧瓶、平板皿、超净工作台、接种环、酒精灯、恒温培养箱、移液枪、试管、恒温摇床 试剂 LB固体培养基： Tryptone 10 g/L ， Yeast extract 5 g/L， NaCl 5 g/L（ph7.4-7.6）琼脂1.5% 抗生素：氨苄、卡那霉素 注意：LB培养基121℃，20min高压灭菌，待冷却至50-60℃时，加入所需的抗生素，摇匀，倒制平板。 方法一：SDS碱裂解法少量抽提质粒DNA 裂解： 取1.5 mL菌液离心(12000 rpm，1 min), 尽可能地吸干培养液。将沉淀重悬于150ul的碱裂解液I中，剧烈振荡。 加入200 ul现配的碱裂解液II，轻轻地快速颠倒混匀5次，冰浴5min。 从冰箱中取出碱裂解液III，加入150ul至EP管中颠倒混匀，冰浴5 min后离心。 加入等体积的酚和氯仿后离心，小心地吸取上清液到新的管中。 回收质粒DNA: 加入双倍体积的无水酒精，充分混匀后，冰浴3h。4度离心10 min,弃上清。 加入1 mL的70%的无水酒精清洗一次，4 °C, 12000 rpm离心10 min，弃上清，将开口的EP管于室温下使酒精挥发，约10 min左右。用50 ul的RNA酶（40 uL/mL)的ddH2O重新溶解核酸，温和的振荡几秒，-20度保存备用。 琼脂糖凝胶电泳： 材料： 离心机、移液枪、冰盒、EP管等 试剂 碱裂解液Ⅰ： 50nmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 碱裂解液Ⅱ： 0.2N NaOH（从10N贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS碱裂解液Ⅱ要现用现配制，室温下使用。 碱裂解液Ⅲ： 5mol/L乙酸钾 60ml；冰乙酸11.5ml；H2O 28.5ml，保存在4 oC。 方法二、质粒小抽试剂盒（天根、Axgen） 简单快速方便、价格也便宜 EcoR I 和BamH I 双酶切 用限制性内切酶EcoR I 和BamH I 双酶切载体V51-S3和NPM1基因片段，37 oC，4 h。 酶切产物回收（胶回收试剂盒） 将NPM1基因双酶切片段与线性化载体V51-S3连接重组，16℃水浴连接过夜。 1）取10 μL连接产物加入到100 μl E.coli DH5α感受态中，轻轻吹打混匀，冰上放置30 min； 2） 42℃热激90 s，冰浴5 min； 3） 加入1 mL 37℃预热的LB液体培养基，37℃，250 rpm摇菌复苏1 h； 4） 3000 rpm离心2 min，吸去上清，剩余100 μL 菌液用移液枪吹打重悬菌体，涂布于LB/氨苄青霉素（100μg/ml）平板上（涂平板），37℃正置培养30 min，然后倒置培养12 h左右； 5） 挑转化后的若干个单克隆菌落接种到4 mL LB/氨苄青霉素（100 μg/ml）液体培养基中，37℃，250 rpm培养12 h左右，用于提取质粒。 1） 挑E.co