克隆技术PPT.ppt

细胞融合 细胞融合的方法有病毒介导融合、化学融合和电融合三种。 电融合 为使供/受体细胞的接触面与电场方向垂直,更有利于融合,可在待融的供/受体复合物移入两微电极丝所组成的融合小槽内后用一次交流脉冲或手工排步的方式来达到这一目的。 电融合参数 在电融合仪融合槽中加入适量的融合液，将重构卵在融合液液滴中洗2-3遍后，移入融合槽的两电极之间， 融合参数设定为140v/mm，脉宽80us，2个电脉冲，间隔1s。将电融合后的重构卵于培养液（含20%FBS的M2）中洗3-5遍后，放入已平衡好的培养液滴中，CO2培养 箱中培养。20min后观察融合情况，未融合者按上述方法再融合一次，已融合者进行激活 重构卵激活 正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+ 浓度增高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。 目前，激活的方式有电激活、化学激活和注射精子因子激活三种。 电激活参数 激活参数为140v/mm，脉宽20us，2个电脉冲，间隔1s。 重构胚的培养 重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体内培养两种方法。体外培养法相对要简单、方便的多。 目前为大部分核移植所采用。 D E F A B C ? ? 重构胚的遗传学鉴定 利用种属特异性探针（人类X、Y探针）对卵裂球细胞进行荧光原位杂交。 线立体的鉴定有待建立 人兔异种核移植的焦点问题 核移植中线粒体的命运 哺乳动物核移植中,无论采用电融合法还是胞质内注射法构建重构卵,都不可避免地会把部分供体线粒体带入受体卵胞质。两种来源的线粒体在重构胚的各阶段发育中到底会有什么样的变化一直是科学家们研究的热点。 正常情况下,早期胚胎发育是由母源遗传的RNA和蛋白质所控制的,发育到一定阶段后,合子核开始控制基因的表达,由母型基因调控向合子型基因调控的顺利过渡是动物早期胚胎进一步正常发育的必要内在条件之一。 克隆动物的现状 康涅狄格大学报告（2002年） “我们的研究表明，即便克隆动物能够足月产下，基因表达中仍然存在许多异常，这也许能部分地解释克隆动物经常出现的发育异常，包括死亡。”（第一作者杨向中） “这项研究很有根据，有助于解释克隆过程出现的高死亡率。超过80％的克隆动物在孕育期间或出生后不久就会死去。”（麻省先进细胞技术公司医学主任、乳牛克隆专家罗伯特?兰扎博士） 英国基因遗传学监督组织报告（2002年） “英国科学家每年要对数十万只动物进行基因修复和克隆。”“很多试验效果甚微，白白浪费了动物的生命，并常常给动物造成痛苦。流产、早产死亡和不孕往往是这些基因技术产生的副作用。” “动物遭受的痛苦程度及其原因没有收到公众监督和辩论。”“在全球迄今为止所做的1万多例动物克隆试验中，只有124条生命诞生，其中只有65只活到成年。这些存活的动物中很多存在严重的生理缺陷。在一项对40头克隆牛进行的研究评估中，34头存在产前畸形、若干头存在肢体缺陷，而大部分则行动迟缓或身体虚弱。在另一项对80只转基因羊羔进行的研究中，除了3只外，其余全部在12周内死亡，要么是肾脏不正常，要么是大脑和肝脏不正常。” 历史回顾（5） 2001年，美、意科学家联手展开克隆人的工作。 2001年11月美科学家宣布首次克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎，称其目标是为病人“定制”出不会诱发排异反应的人体细胞用于移植。 2004年2月11日，美国《科学》杂志宣布，汉城国立大学研究小组成功克隆出人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。 韩国科学家培育出首只克隆狗 2005年08月05日?09:06 北京晨报 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 治疗性克隆 技术途径包括以下几个步骤： 首先取病人体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞； 在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES 细胞； 对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究； 将定向分化后的细胞移植给病人。 胚胎核移植存在的问题 对于濒危动物来说，由于种群数量有限，卵母细胞较难获得；而在人类，由于伦理等原因，卵母细胞的获得同样困难，这就给体细胞核移植技术在拯救濒危动物和人类医疗方面的应用带来很大的限制。核供体、核受体胚胎来源困难. 限制了核移植技术为人类服务的初衷 解决办法