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新一代测序技术的先锋—SOLiD系统 刘莉莉 DNA测序技术 DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。1977年第一代测序技术的出现。经过30多年的发展，DNA测序技术取得重大进展，以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化，以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。 第一代DNA测序技术 化学降解法 双脱氧链终止法 荧光自动测序技术 杂交测序技术 第二代DNA测序技术 454测序技术 Solexa测序技术 SOLiD测序技术 第三代测序技术 HeliScope单分子测序技术 单分子实时DNA测序技术 纳米孔单分子测序技术 SOLiD技术 SOLiD 全称为 supported oligo ligation detetion 特点：以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝 DNA 片段进行大规模扩增和 高通量并行测序。 通量: SOLiD 3 系统是革命性的，目前 SOLiD 3 单次运行可产生 50GB 的序列数据，相当于 17 倍人类基因组覆盖度。而其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性 更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出。 注水到油 基本过程:在 PCR 反应前，将包含PCR 所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿 物油表面，水溶液瞬间形成无数个矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR 反 应空间。 小水滴：一个 DNA 模板+一个 P1 磁珠 由于水相中的 P2 引物 和磁珠表面的 P1 引物所介导的 PCR 反应，这DNA 模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR 反 应结束后，P1 磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源 DNA 模板扩增产物。 C. 微珠沉积 3’修饰的微珠沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成 1 个、4 个或 8 个测序区域。 SOLiD 系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠， 在同一系统中轻松 实现更高的通量。 D. 连接测序 连接酶 底物:8 碱基单链荧光探针混合物。 探针的 5’末端分别标记了 CY5、Texas Red、CY3、6-FAM 这 4 种 颜色的荧光染料。 探针 3’端 1～5 位:随机碱基，可以是 ATCG 中一种 1、2 位构成的碱基对：是表征探针染料类型的编码区 3～5 位的“n”表示随机碱基 6～8 位的“z”指的 是可以和任何碱基配对的特殊碱基。 测序过程 单向 SOLiD 测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应。 (1)连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含有均质单链 DNA 模板，所以这次连接反应掺入一 种 8 碱基荧光探针。 (2)SOLiD 测序仪记录下探针第 1、2 位编码区颜色信息。 (3)化学处理断裂: 探针 3’端第 5、6 位碱基间的化学键，并除去 6~8 位碱基及 5’末端荧光基团，暴露探针第 5 位碱 基 5’磷酸，为下一次连接反应作准备。 原理 几个循环之后，引物重置，开始第二轮的测序。由于第二轮连接引物 n-1 比第一轮错开一位，所 以第二轮得到以 0，1 位起始的若干碱基对的颜色信息。五轮测序反应反应后，按照第 0、1 位， 第 1、2 位... …的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的 SOLiD 原始颜色序列。 。