利用MTT法测定环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制效果.doc

利用MTT法测定环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：利用MTT法测得环磷酰胺对Hela细胞的增殖确实有较好的抑制作用，通过制片能观察到典型的凋亡细胞和凋亡小体。本实验得在所设浓度梯度内药物使用的浓度越高，其抑制效果越好。药物浓度（x）与其抑制效果（Y）间成一线性关系，其方程为Y=0.0007x+0.3591 ，其中 R2=0.9635.这将为找到合适的使用浓度提高一定的依据。 关键词：MTT法 环磷酰胺 Hela细胞 抑制 前言： 癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一, 攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题.目前已经出现了多种抗癌药物，其中环磷酰胺也是一种较有效果的药物。 　环磷酰胺在体外无活性,但在体内经肝细胞色素P-450 氧化生成中间产物醛磷酰胺(aldophosphamide) ,再在肿瘤细胞内分解出磷酰胺氮芥(phosphamide mustard) 与细胞的DNA 发生烷化作用,形成交叉联结,从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。然而环磷酰胺既能抑制肿瘤细胞生长与繁殖,又会影响人体正常细胞的生长和发育【1】。面对环磷酰胺抗癌药物这把双刃剑，使用时必须把握好其使用，以求以最少的危害达到最好的抗癌效果。对于同一药物，不同浓度对肿瘤的抑制效果不同，找到两者之间的关系有助于找到效果和安全之间的平衡点，将有助于推动人类的抗癌事业。1 材料与方法 1．1 实验材料： 环磷酰胺试剂 MTT试剂（现配现用） 靶细胞 ： 美国购入的海拉宫颈瘤细胞系（HELA 细胞），实验室传代保种待用。 1．2实验方法： 1.21. 接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2～3*104/ml，每孔加入细胞悬液200μl，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。 1.22培养与药物处理：培养箱内培养24～36h，吸出培养液加入不同浓度梯度的环磷酰胺（50、100、200、400 ug/ml）各200 μl，，每个浓度至少接种4孔作为重复实验.并设对照组：不加药物，只加培养液。 1.23. 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150μl，振荡30min，使结晶物充分融解。 1.24比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 1.25计算与分析 2.结果： 表一 环磷酰胺浓度 　对照 50ug/ml 100ug/ml 200ug/ml 400ug/ml 　吸光值 0.869 0.549 0.481 0.430 0.331 　抑制率 　 36.82% 44.65% 50.52% 61.91% 2.1实验效果良好，环磷酰胺对Hela细胞的增殖确实有较好的抑制作用，在MTT试剂的显色作用下，用肉眼也能明显看出药物对细胞的抑制效果，且成一定梯度。在本浓度梯度内药物使用的浓度越高，其抑制效果越好（如表一和图一所示）。由本实验看出400ug/ml的环磷酰胺对Hela细胞的增殖抑制率已高达61.91%，之间的关系为以下线性方程：Y=0.0007x+0.3591 R2=0.9635. 2.2实验中通过制片观察，观察到典型的凋亡细胞和凋亡小体。可见环磷酰胺能通过诱导癌细胞发生凋亡而达抗癌作用。 图一3.分析讨论： 3.1 本实验结果和本实验的其他组（各组所设浓度梯度不同）所得的结论基本一致，确实是随着环磷酰胺使用浓度的升高，其对癌细胞的抑制效果也随之升高。所以单纯从抑制效果出发，增加其使用浓度可以达到增效的目的。但药物不仅对癌细胞增殖有抑制作用,同样对人体正常细胞也会带来不利影响.而且有研究以小鼠为对象，对环磷酰胺的毒副作用进行研究得, 大剂量组(A组)小鼠在每周期给药后1周内,即可观察到行动迟缓、反应迟钝、精神食欲较给药前差,化疗间期有所恢复;小剂量、高频率组(B、C组)小鼠给药后行动较为灵活,反应较为灵敏,精神食欲较给药前无明显变化[2]。因此不能一味地最求高浓度大剂量.要根据个体情况,在一定抑制效果范围内选择合适的浓度. 3.2根据本次试验各组的实验效果比较,抑制率最高的是67.03%(800 ug/ml)与浓度为400 ug/ml的抑制率61.91%相差不大，而且已有较好的效果，所以较推荐使用此浓度。 3.3环磷酰胺能过诱导癌细胞发生凋亡,出现典型的凋亡细胞和凋亡小体。诱导癌细胞凋亡作用与直接杀伤作用造成的坏死完全不同,凋亡的细胞基本不破坏,不会释放出引起炎症的物质,癌细胞通过这种死亡方式而引入一个向恶性程度降低的归