传染病暴发疫情应急检测PPT.pptVIP

RT－PCR反应条件: 50℃ 40分钟； 94℃ 5分钟； 94℃ 30秒，50℃ 40秒，65℃ 50秒，35个循环； 65℃ 10分钟。 （总时间约170分钟） 电泳分析结果 用1 ×TAE配制２%的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入GOLDVIEW(５ｕＬ/100mL),待凝胶冷却至50～70℃左右，倒入胶槽，等胶凝固后放在电泳装置上； 在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合； 将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中； 盖上盖子，接通电源，以 5V/cm 电压（恒定电压）电泳，大约35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳； 5. 在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。 RT-PCR 质量控制 提取RNA：选择一个EV71阳性标本同时提取作对照； PCR扩增：选择至少一个EV71阳性标本RNA同时扩增作对照； 电泳分析：选择合适的Marker （500～1000bp) 实时荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始 模板进行定量分析的方法。 分类(DNA 产物的荧光标记)：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、分子信标  (Molecular Beacon) TaqMan---水解型杂交探针 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等； 3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)； 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开， 发荧光； Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针。 TaqMan法工作原理 TaqMan PCR体系的构成： 引物、TaqMan探针、 dNTPs、 Taq聚合酶、 模板、 相应的缓冲体系等。 典型的Real time PCR四阶段: 荧光阈值(threshold)设定: threshold = 10×SD(cycle 6-15) Ct值： C代表Cycle, t代表threshold,即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光定量PCR标准曲线绘制: 结果分析条件设定和结果判断: 对照结果：阴性对照应为阴性；阳性对照应为阳性； Ct值无数值的（与阴性对照应一致）标本为阴性样本； Ct值≤35.0的样本为阳性； Ct值≥35.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性， 否则为阳性。 荧光PCR特点 灵敏度高 特异性强 全封闭PCR过程，无需后处理，降低污染机会。 即时反映扩增过程，更适用于定量。 可实现一管多检（如：双通道、三通道检测） 仪器自动分析，更快获得结果。 探针设计有一定难度，较难达到一管多检的要求。 出现污染，更难处理。 传染病暴发疫情应急检测 一、实验室检测在传染病疫情中的作用 公共卫生 疾病预防控制 体系 应急反应 体系 医疗救助 体系 卫生监督 执法体系 四个体系 教育培训 人才队伍 公共卫生立法 运行保障 科研 工作依托 ——国家突发公共卫生事件应急预案 一、实验室检测在传染病疫情中的作用 传染病暴发疫情处置流程 一、实验室检测在传染病疫情中的作用 传染病疫情的核实、处置、总结评价等方面离不开实验室检测结果的支持。如传染病的诊断应包括流行病资料、临床病史、体格检查和实验室检验结果等，再者病原体的检出是确诊传染病的主要依据。 一、实验室检测在传染病疫情中的作用 2.肛拭子 采集病人发病7日内的肛拭子标本用于病原检测。用采样棉签沾取少量生理盐水，适度用力插入患者肛门，同一方向旋转采样棉签，取出棉签放入装有3～5ml保存液（维持液、或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。 3.咽拭子 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签,适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位,应避免触及舌部;迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖并密封。 4.疱疹液 　 局部皮肤消毒后(建议使用75%酒精,不能使用碘酒),用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装3 ～ 5ml病毒保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。可同时采集同一病例的多个疱疹作为一份标本。 5.血液样本的采集：作血液病原培养、核酸检测时,严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无菌的有螺口