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利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(9):68~76
利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤鸟嘌呤
磷酸核糖转移酶基因打靶载体
1 3 1 2 4 2
张传山 李 峰 姚 刚 郭 毅 鲍柳君 陈学进
(1新疆农业大学动物医学学院 乌鲁木齐 830052 2上海交通大学医学院实验动物科学部 上海 200025)
(3中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 上海 200092 4苏州大学生命科学学院 苏州 215006)
摘要 利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase,HPRT)基因突
变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆
(LBNL1304M19)的基础上,利用Red重组系统,通过GapRepair方式从此克隆上将一段47kb无
启动子的 HPRT基因组片段 (不含有第 1个外显子)克隆到 pBACLinkSp质粒上,产生
pBACLinkSprHPRT质粒。然后基于pBACLinkSprHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了
HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技
术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打
靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲
除动物疾病模型奠定了基础。
关键词 Red重组 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 基因敲除 载体
中图分类号 Q784
基因敲除是自上世纪80年代末发展起来的一种 是从头合成途径(denovosynthesis)。二是利用腺嘌呤
新型分子生物学技术,其原理是应用外源DNA与受体 磷酸核糖转移酶(adeninephosphoribosyltransferase,
细胞基因组上的同源序列之间可以发生同源重组,从 APRT)及次黄 嘌呤 -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
而使外源DNA整合到受体细胞基因组的特定位点上, (hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase,HPRT)
实现精确、定向的基因删除或替代,而不累及其它基 的补救合成途径(salvagepathway)。HPRT基因突变会
[1,2] 导致次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶功能降低或完
因 。
[3] 全丧失。人体内HPRT功能降低,尿酸(嘌呤代谢的产
2001年,Lee等 将基因缺陷型的 噬菌体导入
λ
大肠杆菌DH10B,构建了一种新的具有重组功能的菌 物之一)将在体内累积,引发痛风性关节炎、肾结石和
株DY380(Red重组系统)。在此基础上,将 Cre基因 膀胱结石;功能完全缺失则会导致累 -奈综合征
[5]
(被阿拉伯糖诱导的启动子 P 严紧控制)诱导进入 (leschnyhansyndrome,LNS) ,亦称自毁容貌症。LNS
BAD
DY380,产生了 EL350菌株(基因型为 DY380[(cro 患者还表现为神经和行为的异常,但具体原因还不清
bioA [4] 楚。通过基因打靶技术敲除HPRT基因建立的雄性小
)<>araCP re]) 。
BADC
哺乳动物体内嘌呤核苷酸的合成有两条途径。一 鼠LNS疾病模
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