尼罗罗非鱼无乳链球菌基因缺失株ΔcpsE和ΔneuA的-中国水产科学.PDFVIP

中国水产科学 2017 年9 月, 24(5): 977987 Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: 10.3724/SP.J.1118.2017.17131 尼罗罗非鱼无乳链球菌基因缺失株ΔcpsE 和ΔneuA 的构建及其生 物学特性 1, 2 1 1 1 1 1 1 1 师红亚 , 董浚键, 张德锋, 孙成飞, 田园园, 曾庆凯, 卢迈新, 叶星 1. 中国水产科学研究院 珠江水产研究所, 农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室, 广东 广州 510380; 2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306 摘要: 为探究尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因cpsE 和neuA 对菌株生物学特性的影响, 本研究利用 同源重组的方法, 构建了GBS 的cpsE 与neuA 的单基因缺失突变株。具体方法为: 用Infusion-PCR 的方法分别构 建带有氯霉素抗性基因的 cpsE 与neuA 基因敲除重组质粒 pSET4s-cpsE 和pSET4s-neuA 。将构建好的质粒电转化 入 GBS 感受态细胞中, 通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失, 最后经氯霉素抗性筛选获得疑似敲除株。通过 菌落PCR 、RT-PCR 及DNA 测序等方法对疑似敲除株进行验证。结果显示 GBS 的两个突变株ΔcpsE 和ΔneuA 被 成功构建。在此基础上, 通过生物学功能分析比较基因缺失突变株ΔcpsE 、ΔneuA 与野生株在菌株生长速率、荚膜 多糖厚度、唾液酸含量和毒力方面的差异。结果发现缺失突变株ΔcpsE 和ΔneuA 的生长速度与野生株无显著差异, 但荚膜多糖厚度、唾液酸含量和菌株毒力均显著低于野生株。进一步研究显示, cpsE 是鱼源GBS 荚膜多糖合成的 关键基因, neuA 基因则是荚膜多糖唾液酸化的关键基因, 它们的缺失导致了 GBS 荚膜唾液酸含量的降低, 且显著 降低了菌株的毒力。 关键词: 尼罗罗非鱼; 无乳链球菌; 荚膜多糖合成基因; 基因敲除; 生物学特性 中图分类号: S917 文献标志码: A 文章编号: 10058737(2017)05097711 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)为兼性 polysaccharides, CPs) 、CAMP 因子、表面免疫原 厌氧革兰氏阳性菌, 又被称为 B 群链球菌(group 性蛋白 Sip、C 抗原 α蛋白(bca 基因编码蛋白)和 B Streptococcus, GBS) 。它可引起人类的败血症、 C5a 肽酶(ScpB)等[9–12] 。绝大多数GBS 的荚膜多 肺炎及脑膜炎等疾病, 也是引起猪、牛等陆生脊椎动 糖由 4 种单糖组成, 分别为葡萄糖、半乳糖、N- 物和鱼类等水生动物链球菌病的主要病原菌[1–2]。根 乙酰葡糖胺和一个末端保守的唾液酸。唾液酸化 的荚膜多糖对GBS 的毒力起着重要作用[13] 。GBS 据 GBS 荚膜多糖的特性已鉴定出 10 种血清型, 荚膜多糖的合成受 16 个 cps (capsular polysac- 分别为Ia, Ib, II–IX, 其中对鱼类具有较强致病性 charide synthesis)基因的控制, 包括cpsA~cpsL 和 [3] [4–5] [6] 的为Ia 、Ib 和III 型 。近年来, 无乳链球菌