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第四章药物的定量分析与方法验证-du第六版.ppt

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第四章药物的定量分析与方法验证-du第六版

去除蛋白质方法: 1.加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂,可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚,使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有:乙睛、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:(1-3)时,就可以将90%以上的蛋白质除去,采用超速离心机(10000r/min )离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。 2.加入中性盐 使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来,从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用的中性盐:饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用,药物的回收率高。 3.加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形式存在,加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有:10%三氯醋酸等。含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合,高速离心,就可除去蛋白质,取上清液作为样品。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时,金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有:CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合,高速离心、分离后得上清液。 5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时,常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素,使蛋白质的肽键降解。 (二)缀合物的水解 尿中药物多数呈缀合状态。 含羟基、羧基、氨基和巯基的药物。可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物。 含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性,不易被有机溶剂提取,常用酸水解或酶水解的方法。 (三)分离、纯化与浓集 1.液-液提取法 多数药物是亲脂性的,在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度,而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。 对有机溶剂的要求: 对被测组分的溶解度大,沸点低,易于浓集、挥散;与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂:乙醚和氯仿等。 用量:一般有机相与水相(体液样品)体积比为1:1或2:1。 生物样品一般多在碱性下提取,多数药物是亲脂性的碱性物质,生物样品中的内源性物质多是酸性的。 当碱性药物在碱性pH不稳定时,则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。 2.液-固提取法(liquid-solid extraction,LSE) 将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱,以溶剂淋洗后,将生物样品通过,使其药物或杂质保留在担体上,用适当溶剂洗去杂质,再用适当溶剂将药物洗脱下来。 LSE具有优点:LSE较少引入杂质;消除了LLE的主要缺陷—乳化现象;提取效率高,可用少量生物样品进行分析;柱为可弃型,废弃物易从实验室移走;在最后洗脱中多数采用以水为主的溶剂系统,大大增加了安全性;最大的优点为处理样品速度快,并在室温下操作,尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。 常用于填充柱的担体大致分为两类: 1.亲水性的硅藻土,有机溶剂冲洗药物 2.疏水活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶,吸附亲酯性药物,然后用有机溶剂分离药物。 3.被测组分的浓集的方法: 末次提取时加入的提取液尽量少,然后直接测定。 氮气流吹干 减压法挥去溶剂 三、生物样品定量分析方法验证 (一)特异性 证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物。 (二)标准曲线与线性范围 回归方程相关系数r≥0.9900。在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 (三)精密度与准确度 药典附录《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》规定考察3个浓度的精密度和准确度。 一般RSD应小于15%,在LOQ附近RSD应小于20%。 批内精密度:是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5%以内,但不能超10%。 批间精密度:是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15%以内。 回收率:一般应在85%-115%范围内,在LOD附近应在80%一120%范围内。 (四)最低定量限 最低定量限LOQ至少能满足测定3-5个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的1/10-1/20时的药物浓度。 (五)样品稳定性 在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察,以确定生物样品的存放条件和时间。 (六)提取回收率(绝对回收率) 考察高、中、低3个浓度的提取回收率,它是预处理(提取)过程的回收率,反映出样品预处理过程中组分丢失的情况,是评价萃取方案优劣的指标之一,一般低于100%,但是重现性要好。 (七)质控样品 质控样品系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品,用于质

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