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第四章 沉 淀 法 (precipitation);生物分离过程的一般流程;第一节 沉淀法概述 第二节 盐析法 第三节 有机溶剂沉淀法 第四节 等电点沉淀法 第五节 其他沉淀方法 第六节 沉淀法应用;一、沉淀法的概念 利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。;二、沉淀法的目的;为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀 ;沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 ;六、沉淀法的分类; 七、蛋白质的溶解特性;;;;一、盐析的概念;二、盐析法机理;中性盐盐析法机理示意图;三、盐析过程;;盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济;在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子。;盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。 （1）价廉； （2）溶解度大； （3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好； （4）不易引起蛋白质变性。 ; 由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类： ;1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；速度不能太快，分批加入。搅拌需适中。 2）加入饱和溶液法 用于饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3）透析平衡法 优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。;一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。; ;㏒S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度，I=1/2∑mizi2 mi—离子i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率;β和Ks的物理意义 β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率；Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不大。;用盐析法分离蛋白质的二种方法;盐析用盐量的确定-饱和度（Saturation）：;原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？;原蛋白溶液饱和度为S1，现饱和度增加为S2，需加入多少饱和硫酸铵溶液?;加固体硫铵的方法;在20 ℃时使1L S1饱和度时（NH4）2SO4溶液增至S2饱和度，所需加入（NH4）2SO4的克数：;以上数据都可在有关书上查到 ;20;在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。 ;3、pH值;;4、温度的影响; 5、蛋白质浓度;起始浓度30g/L的COMb，大部分蛋白质在58-65％饱和度沉淀； 稀释10倍的COMb溶液，饱和度达到66%才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。;五、盐析注意事项;盐析注意事项——硫酸铵的使用;六、盐析法特点;;蛋白质属于两性电解质，溶液pH值高，蛋白质带负电；pH值低，带正电。当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，这时的pH值为等电点，常用pI表示。 两性电解质在溶液中pH处于等电点pI时，分子表面静电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。;不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。;;①等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物(杂质)也少。是一种常用的分离纯化方法。 ②收率低：等电点附近（处）仍有一定的溶解度，(有时甚至比较大)，沉淀不完全。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率。很少单独使用，与盐析，有机溶剂沉淀等结合使用。;; 三、等电点沉淀注意事项 (1) 生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。 由于无机离子的影响，