第2章节 细胞培养的条件.doc

第2章 细胞培养的条件 细胞培养的条件应模拟体内的生长环境，除定时输送培养液满足细胞生长所需的营养外，还要考虑到细胞生长的环境如温度、气体环境和氢离子浓度及渗透压等，细胞培养的设施也是非常重要的。 第一节 细 胞 的 营 养 离体细胞与体内的细胞在营养代谢上是有区别的。机体内的细胞营养可受神经和激素等进行一系列的统一调节，而离体的细胞则不受其调节。 离体培养细胞与体内细胞在营养要求上的主要差别如下： （1）体外长期培养的细胞大多需要血浆、血清或胚胎浸出液，而这类培养液都可能含有微量的激素、维生素及必要的氨基酸，足以供给细胞营养的需要。 （2）在体内血液中许多活性很强的物质只需微量即可维持营养的需要，而在体外培养时无法观测，量多了可能与微量的作用不同，量少了又可能很快就会消耗掉。 (3) 组织培养是一群离体细胞，而这些细胞有不同的营养要求。这种不同的营养要求在体内因有别种器官和组织细胞的活动而间接供给，但在培养基中则没有这种供给，也不受其他组织代谢的影响。 （4）各种组织都有其特殊的营养要求，能适合某一种组织的培养液，不一定就能适合另一种组织的细胞，其差异有时较大。 5、在体内的细胞，其新生与衰亡维持一种平衡，而在体外培养时，细胞增生，体积加大，增殖速度往往高于分化速度，新生细胞比衰亡细胞要快，所以营养要求自然也不同。 由此可见，各种不同的细胞具有不同的营养要求。因此，细胞营养的研究在组织细胞培养中非常重要。 凡能进入细胞中被细胞所利用，参与细胞代谢活动和维持细胞生存的物质均属营养物质。体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除碳水化合物、氨基酸和脂类三大类营养物质外，也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等。 一、水 水是一种良好的溶媒。人体细胞中大部分是水。一切营养物质只有溶于水，才易被细胞吸收。代谢产物也需溶于水才能排泄。生化反应也必须在溶液状态下才能很好起作用。水的比热高、潜热大，对调节温度起着很大作用。水有一定的表面张力，对生物形态的保存也有一定作用，且原生质的活动需要水的表面张力。没有水，水解反应和氧化作用无法进行。水也影响呼吸。水还便于溶质物质的转移。水作为一种导热体，对生物体内环境温度的调节起重要作用。水中有溶解氧的存在，可供细胞呼吸，可维持水中有机体的生存。细胞培养用水必须经过2～3次玻璃器皿蒸馏或者用离子交换树脂处理的水。这样的水含杂质少、纯度高，应用起来安全可靠。一般在电导仪上表示200～300万Ω以上方可使用，生长液要在500万Ω以上。 二、糖 细胞靠糖的氧化来获得能量。葡萄糖是机体活动能量的主要来源。故在培养液中应加入一定浓度的葡萄糖(1g%)，以在生物氧化后供给细胞大量的能量。近年证明谷氨酰胺也是碳的重要来源。葡萄糖的作用与平均细胞容积有直接的关系，而与细胞数的变化关系较小。很多健康胚细胞和成体细胞，皆依赖无氧酵解来获得能量，有些细胞也可以经脱氨获得基本能量。 三、氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。所有培养细胞需要以下12种基本氨基酸：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、胱氨酸及酪氨酸。另外尚需谷氨酰胺。谷氨酰胺对细胞具有特殊作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜。它所含的氨又是核酸中嘌呤和嘧啶的重要来源，同样也是合成3，2和一磷酸腺苷时的所需物，也是能源和碳的来源。因此，谷氨酰胺对培养细胞非常重要，肿瘤细胞培养时比正常细胞需求量高1倍。很多细胞在含氨基酸的培养液中生长良好，尤其是在单细胞培养或培养细胞较少时，需要氨基酸的种类和量要比上述的多。有时细胞培养还加以下7种氨基酸，即天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸（非必须氨基酸）。尤其是丝氨酸对很多癌细胞、成纤维细胞生长很重要。细胞只能利用左旋的异构体，而右旋的即使超量也无用。 半胱氨酸的主要作用是保护酶的活力，可消除培养液中的微量金属与细胞内酶结合后形成的抑制硫苷酸；可增加细胞的增生数和改善细胞的外形，延长细胞的生存时间。目前采用的浓度增加到26g/L，需新鲜配制于母液中，否则因氧化作用而失去效应。 甘氨酸是一种最简单的氨基酸。它对细胞的大量生长有一定的促进作用。可通过转氨基作用形成丙氨酸、谷基酸与苯丙氨酸，反过来丙、谷氨酸，谷氨酰胺也可通过转氨基作用形成甘氨酸。使用浓度一般为50mg/L。 丝氨酸并不是必需的氨基酸，可部分地被甘基酸、丙氨酸或几种不重要的氨基酸结合物所代替，但它对肿瘤和成纤维细胞有促进生长的作用，如果与丙氨酸、α-氨基酪酸、天门冬酰胺结合，能进一步增加丝氨酸的促进作用。适宜用量为0.5～1.0mmol/L。 色氨酸的主要作用是可通过转氨基作用产生丙、甘、酪氨酸。适宜用量为0.005～0.02mmol/L。