第五章节 酶分子修饰.ppt

第五章 酶分子修饰 通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术称为酶分子修饰。 酶分子修饰技术不断发展，修饰方法多种多样。酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰等。 本章着重叙述酶分子修饰的方法和应用，介绍酶分子修饰的现状及进展。 试剂的选择 实验目的不同，对专一性的要求也不同，因此，选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。例如，对氨基的修饰可有几种情况：修饰所有氨基，而不修饰其他基团；仅修饰某种氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性pH下带正电荷的氨基转变成在中性pH下带负电的衍生物。如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质中进行反应，则试剂应选择在水中有一定溶解性的。在选择试剂时， 还必须考虑反应生成物容易进行定量测定。如果引入的基团有特殊的光吸收或者在酸水解时是稳定的，则可测定光吸收的变化或做氨基酸全分析，这是最方便的。用同位素标记的试剂虽较麻烦，但有其优越性，它可对蛋白质修饰反应进行连续测定，进行反应动力学的研究。试剂的大小也要注意。试剂体积过大，往往由于空间障碍而不能与作用的基团接近，一般来说，试剂的体积小一些为宜，这样既能保证修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏酶分子严密结构的危险。 一般地说，选择酶修饰剂要考虑如下一些问题：修饰反应要完成到什么程度；对个别氨基酸残基是否专一；在反应条件下，修饰反应有没有限度；修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物；反应是否需要可 是否适合于建立快速、方便的分析方法等。在决定选择某一修饰方法之前，对上述问题必须有一个权衡的考虑。 用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下一些特征：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来，进行鉴定；反应的程度9目用简单的技术测定。当然，不是单独一种试剂就能满足所有这些条件。一种试剂可能在某一方面比其他试剂优越，而在另一方面则较差。因此，必须根据实验目的和特定的样品来决定使用什么样的试剂。 反应条件的选择 蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求。 一是不造成蛋白质的不可逆变性。为了证明这一点，必须做对照试验。二是有利于专一性修饰蛋白质。为此，反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。反应的温度、pH都要小心控制。反应介质和缓冲液组成也要有所考虑。缓冲液可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应，如磷酸盐是某些酶的竞争性抑制剂，因氮离子的结合可能封闭修饰部位。碳酸酐酶的酯酶活力能被氯离子抑制，因而修饰反应所用缓冲液不应含有氯离子。 反应的专一性 在蛋白质化学修饰研究中，反应的专一性非常重要。若修饰剂专一性较差，除控制反应条件外，还可利用其他途径来实现修饰的专一性。 a.利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 活性蛋白质特殊的空间结构能影响某些基团的活性。蛋白水解酶分子中的活性丝氨酸是一个很突出的例子。二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，结果迅速导致酶失活。但DFP在同样条件下却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。在蛋白质分子中特别活泼的基团，如上述活性丝氨酸在适当条件下只是其本身发生作用，而其他基团皆不作用，这种现象称为“位置专一性”，因为这是由于它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。 b.选择不同的反应pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。例如，用溴(碘)代乙酸(或它的酰胺)对蛋白质进行修饰时，试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α—氨基、ε—氨基发生作用。 当反应pH为6时，只专一地与组氨酸的咪唑基作月；当反应pH为3时，则专一地与甲硫氨酸侧链作用。在这样酸性pH下，比较活泼的巯基和氨基都以带质子的形式存在，而变成不活泼状态，如式(3—4)所示： c.利用某些产物的不稳定性 在高pH下，用氰酸、二硫化碳、O—甲基异脲和亚氨酸等，可将氨基转变成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pH高，与巯基形成的产物迅速被分解。 d.亲和标记 亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。因此，在作用前，试剂先