第四章节 酶的提取与分离纯化.ppt

第四章 酶的提取与分离纯化 蛋白质分离纯化技术无论对酶工程还是对基因工程的发展都是至关重要的。据统计，生物工程产品研究中，70％的经费和人力要用于下游工程。DNA重组技术的问世，遗传工程的蓬勃发展，推动着酶工程的兴起。今天，生物化学家们不仅可以利用各种先进、灵活的蛋白质化学技术纯化、分离获得天然的蛋白质和酶，而且也可以结合分子生物学技术的引入，改造和设计生产出那些自然界不存在或存在量甚微，或使之具有人们所期望的新性质的酶与蛋白质。 一、酶纯化的一般考虑 纯化酶所进行的战略设计最主要是考虑应用。下列各点是应认真遵循的。 ①分离纯化用的原料来源要方便，成本要低；目的酶含量、活性相对要高；可溶性和稳定性要好； ②生物活性分子一旦离开它赖以生存的生态环境则易破坏天然构象，即易变性。因此，破碎细胞的条件要尽可能十分温和。尽早尽可能多地去除各种杂质、脂类、核酸及毒素，近年来发展起来的双液相蛋白萃取技术可同时去除这些杂质干扰。使用极性条件要以目的酶的活性和功能不受损害为原则。低温和洁净的环境必不可少，要设法避免和防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、去污剂、高温、剧烈的机械作用等诸因素。器皿以聚乙烯塑料代替玻璃制品，尤其在稀溶液的操作中更应如此. ③分离纯化的大部分操作是在溶液中进行的。各种参数如pH、温度、离子强度等溶液中各组分对生物活性分子的综合影响常常无法固定，以致分离、纯化操作带有很大的经验成分，因此，操作缓冲液中的物质成分要审慎地思考，避免随意性。除去对 可溶性及缓冲容量的考虑之外，蛋白水解酶和核酸酶的抑制剂、抑制微生物生长的杀菌剂、稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂及金属离子等均应依不同酶的性质、结构予以周全考虑。 ④建立灵敏、特异、精确的检测手段，是评估纯化方法，判断目的酶产率、活性、纯度的前提。因此，建立灵敏特异性的检测方法，是绝对重要的。酶活性检测可根据特异性底物的反应；其他目的蛋白酶的检测在未能建立特异性的免疫学检测方法之前不仅要测定它的总生物活性，还要有相应判定指标，保证检测的特异性。 此外要保证有足够灵敏的检测方法，无破坏性紫外线检测装置的灵敏度要高，吸收波长选取适当。 ⑤纯化策略的选择 表1—7概述了酶、蛋白质、重组蛋白质的各种分离纯化技术。常用的有凝胶过滤、离子交换、色谱聚焦、疏水作用、亲和分离等。 工艺次序的选择策略包括：应选择不同机制的分离单元组成一套工艺；应将含量多的杂质先分离去除；尽早采用高效分离手段；将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质(包括非蛋白质类杂质)，随后是高分辨的操作单元，如具有高选择性的离子交换色谱和亲和层析，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可使分离效益提高。 色谱分离次序的选择同样重要，一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤间的过渡。离子交换、疏水和亲和色谱通常可起到蛋白质的浓缩效应，而凝胶过滤色谱常常使样品稀释。在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的更换，因为多数蛋白酶在高离子强度下与疏水介质结合能力较强，凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成形保存。 最后需要提出的是近年来出现的集色谱分离与膜分离于一体的径向色谱柱(radial flow chromatographic column)分离技术，它采用径向流动技术，样品和流动相是从柱的周围流向圆心，故可在较小的柱床层高度下使用较大的流动相流速，而反压降却较低，样品出峰快。由于它改变了传统的长轴流向的柱体设计和具有多层键合功能基基团的交换膜，因此色谱分离的流量和负荷量大大提高，同时又由于柱体的设计可在长轴上加长、缩短和并联，因此分离规模可在基本类似的色谱条件下不断放大，适合于生物工程产品的初级分离纯化。 生物工程产品的巨大市场潜力推动着生物大分子分离纯化技术的革命。美国BioCAD Workstation生物公司已推出灌注层析系统(BioCAD peffusion chromatography)，在BioCAD工作站上配备了pH、电导监测器、双波长紫外线／可见光(190～800 am)检测器、六样四元系统及自动进样器，还可利用阀门转换选择不同的管柱。使用BioCAD工作站操作方便、快捷、自动化程度高，其分离速度比传统技术快10-100倍，仅用30 s至3 min，即可完成一个样品的纯化和分析，为生物大分子的快速分离纯化提供了有力的工具。 分离介质是在Polystyrene divinylbenzene高度交联的基础上构成，与传统介质相比有许多独特性，介质POROS为双模式孔结构，在介质上有80