第二章 研究方法 细胞生物学课件.pptVIP

第一节 显微技术 显微镜是观察细胞的主要工具。 根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。 一、光学显微镜 普通光学显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦扫描显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 普通光学显微镜 普通生物显微镜由3 部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察。 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm 处）能分辨物体最小间隔的能力。 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 激光共聚焦扫描显微镜 激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。 统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，能显示细胞样品的立体结构。 暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 利用这种显微镜能见到小至4~200nm 的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50 倍。 相差显微镜 相差显微镜（phasecontrast microscope）由P．Zernike 于1932年发明，并因此获1953 年诺贝尔物理奖。 这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 二、电子显微镜 透射电子显微镜 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm 的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。 1932 年Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）。目前TEM 的分辨力可达0.2nm。 二、电子显微镜 扫描电子显微镜 在光学显微镜下扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20 世纪60 年代问世，用来观察标本的表面结构。 其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本的表面结构。 三、显微操作技术 显微操作技术（micromanipulation technique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 二、显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。 例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。 根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。 三、放射自显影技术 放射自显影技术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 其原理是将放射性同位素（如14C 和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 第三节 细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。 一般认为，转速为10~25Kr/min 的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kg者称为超速离心机。 （一）、差速离心 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 （二）、密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平