3提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性.ppt

RT-PCR原理及方法 报告人：樊凤娇 一 、 RT-PCR反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。 1 RT-PCR反应体系： 1.1 模板 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。模板RNA最常见的问题是RNA降解或混有基因组DNA。 1.2 逆转录酶 1.3 DNA聚合酶 1.4 引物 2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成， 有助于减少污染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。 2.3 一步法与两步法区别： 一步法更方便，且可防止在管与管之间转换过程中污染样品，可适用于大量样品分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息。陈阳婷等在研究一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较中得出，两步法RT-PCR具有较高的灵敏性，但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。 3 提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性： 3.1 首先应确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好，可提高逆转录反应温度。 3.6 设计引物时，避免在引物3′端含有互补序列，避免可以形成内部发卡结构的序列。 4： RT-PCR中PGES和PGFS引物以及内参引物 序列 Suranga P Kodithuwakku Spermatozoa stimulate prostaglandin synthesis and secretion in bovine oviductal epithelial cells 三： RT-PCR技术原理及数据分析： 实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 图 1 实时荧光扩增曲线图 荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 两个概念： 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，为了便于对所检测样本进行比较，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般这个阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline）,荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号。 CT 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 CT 值 荧光探针和荧光染料： RT-PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。 荧光染料 （ SYBR Green I ） SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增