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流式细胞分析在动物学研究中的应用 　　1 引言 　　流式细胞分析是利用流式细胞仪对荧光分子标记的动植物细胞、细菌、病毒以及其中的DNA、RNA、各种蛋白或其它分子进行研究，也可用于研究塑料微球或其他悬浮于液体中的微粒，是对液相中的细胞或微粒进行参数快速分析和分选的技术[1]。流式细胞仪集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体[2]，灵敏度高、测量速度快、被测群体大且能进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量[3～5]。目联盟前已广泛运用于医学、生物学、材料学等领域，特别是在医学及生物学领域得到较快的发展。在生物学中，流式细胞仪用于植物研究中较少，而在动物学中的应用相对较多。 　　流式细胞仪的发展及原理 　　1934年，Andrew Moldaran开始了流式细胞分析的第一步，他通过显微镜技术，发明了一个能让细胞通过毛细管，并能对细胞进行计数的仪器[1]。1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置，成为了流式细胞仪的雏形[6]。1967年，Kamentsky和Melamed在此基础上设计了分选仪器，它能给注射器提供电刺激，从液流中找出目标细胞，再进行观察分析，这就是流式分选的雏形[1]。1969年，Marvin van Dilla报道了第一台荧光检测的流式细胞仪，它用氩离子激光作为光源，包括照射、电子检测以及液流系统[1]。后来，流式细胞仪朝着能检测和分选不同类型细胞的大型机以及功能越来越强大、系统稳定发展的小型机两个方向发展[1]。 　　流式细胞仪的原理：目前使用的流式细胞仪包括4个系统：液流系统、光学检测系统、电子控制系统以及分析系统[1]。具有分选功能的流式细胞仪还具有分选系统[7]。其原理是进行荧光染色的悬浮细胞或微粒在压力下，经鞘液包绕形成鞘流，依次进入流式照射室的检测点，氩离子激光照射细胞发出散射光和荧光，其信号强弱与细胞内待测组分含量成正比[1，6]。散射光和荧光被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收放大后转化成电信号，再经转换器形成数据文件，储存在计算机上，以备脱机后的数据处理和分析[7]。 　　流式细胞仪的分选原理：具有分选功能的流式细胞仪通过细胞分选器分离含有单细胞的液滴完成细胞分选检测。由喷嘴喷射出的液流柱经高频的压电晶体产生高频振荡，斷裂形成均匀的液滴，根据选定的参数判明是否将被分选，而后对选定的细胞液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过静电场发生偏转，后落入收集器中，通过不同孔径的喷孔及液流速度，实现细胞分选[6，8]。 　　流式细胞分析在动物学中的应用 　　近年来，随着生物学研究的深入，流式细胞分析作为一种重要辅助研究的方法被广泛应用于生物学领域，特别是动物学、细胞生物学等领域。 　　我国对流式细胞仪的研发起步较晚。1981年，北京师范大学生物系引进了国内第一台流式细胞仪[7]。此后，流式细胞分析不仅在科研领域，而且在临床医学等领域得到了较快的发展。 　　流式细胞分析最早用于细胞的分选以及血细胞的分类研究。1975年，Gray[9]首次运用流式细胞仪观察用DNA荧光染料染色的中国仓鼠细胞中的染色体，根据染色体上染色含量的不同将单个染色体进行分拣。1984年，De Laat 和 Blass[10]首次报道了运用流式细胞分析识别和分拣植物染色体。国内最早的流式细胞分析应用是许秀芹，王宜艳[11]等学者，其利用流式细胞分析将海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎等的血细胞分成透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞3个亚群。 　　 流式细胞分析在水生动物中的应用 　　流式细胞分析早期应用于水生生物的研究中。沙爱龙[1]在Ashton-Alcox[12]与刘东武[13]等国内外学者应用流式细胞分析将美洲牡蛎、中国蛤蜊和紫石房蛤的血细胞分为3类的基础上，利用流式细胞仪将短蛸的血细胞分为大透明细胞、小透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞4种类型，他的研究表明与王晶[14]的活体染色方法相比，流式细胞分析更为方便可行，研究结果也更为精确。此外，沙爱龙[1]还概述了流式细胞分析在水生无脊椎动物细胞免疫学、染色体核型分析、无脊椎动物细胞核等方面的应用，并提出随着流式细胞仪的发展，它将会应用到无脊椎动物的生殖与遗传研究中，推动其分子细胞水平的研究。高如承[15]等就流式细胞分析在水生动物细胞分类、分选、细胞免疫功能、DNA研究以及精子质量评价方面进行了综述。流式细胞仪能快速、准确地量化大量单细胞的形态和功能，能更好地了解双壳类机体的免疫状况，从而保证养殖业更好地发展。Michael等在单细胞水平上利用荧光标记及流式细胞仪对美国东部的牡蛎防御机制进行了量化，结果发现颗粒细胞的吞噬活性和呼吸爆发活力最强，中间颗粒细