小分子RNA干扰雷帕霉素靶蛋白基因表达对百草枯致大鼠肺纤维化的影响.pdfVIP

· 830 · 中华危重病急救医学 20 17 年 9 月第 29 卷第 9 期 Chin Crit Care Med ，September 20 17 ，Vol.29 ，No.9 ·论著 · 小分子 RNA 干扰雷帕霉素靶蛋 白基 因表达 对百草枯致大鼠肺纤维化的影响 ， （ 、 、 ）； ， 27 1600 110000 （ ） ： ， ： Email 18272 14480@ DOI ：10.3760/cma.j .issn.2095-4352.20 17.09.0 13 【 】 摘要 目的 探讨小分子 RNA 干扰雷帕霉素靶蛋 白（mTOR ）基 因表达对百草枯致大 鼠肺纤维化 的影 响。方法 体外培养人胚 肾细胞 HEK-293 ，构建 mTOR 小干扰 RNA （mTOR-siRNA ）表达质粒转染慢病毒 ，并 以与 mTOR 基 因无 同源性 的非特异性序列质粒作为对照。将 72 只健康雄性 SD 大 鼠按随机数字表法分为生理 盐水 （NS ）对照组 、百草枯模型组 、mTOR 无关序列组 、mTOR-siRNA 组 ，每组 18 只。经腹腔注射 20% 百草枯 溶液 15 mg/kg 制备百草枯 中毒动物模型 ，NS 对照组腹腔注射等量 NS ；mTOR 无关序列组和 mTOR-siRNA 组 大鼠分别经气道 内注入滴度为 1 ×109 TU/mL 的慢病毒溶液 50 μL ，NS 对照组和百草枯模型组注入等量 NS。各 组分别于 7 、14 、28 d 处死 6 只大 鼠取肺组织 ，光镜下观察病理学改变及纤维化情况 ；采用碱水解法检测肺组织 羟脯氨酸 （HYP ）水平 ；采用反转录 - 聚合酶链反应 （RT-PCR ）和蛋 白质免疫印迹试验 （Western Blot ）分别检测 肺组织 mTOR 的 mRNA 和蛋 白表达 。结果 光镜下显示 ，NS 对照组肺组织无 明显病理学改变 ；百草枯模型组 和 mTOR 无关序列组肺组织结构破坏 ，有大量炎性细胞浸润 ，并 出现大量基质胶原及纤维组织增生 ，且随时间 延长逐渐加重 ，符合百草枯致肺组织纤维化过程 ；而 mTOR-siRNA 组沉默 mTOR 基 因后肺组织病理学及纤维 化改变 明显减轻 。百草枯模型组和 mTOR 无关序列组肺组织 HYP 水平 以及 mTOR mRNA 和 mTOR 蛋 白表达 量均呈时间依赖性持续升高 ，且 明显高于 NS 对照组相应时间点 ；而 mTOR 无关序列组与百草枯模型组无 明显 差异 。mTOR-siRNA 组沉默 mTOR 基 因后能抑制百草枯 中毒导致肺组织 中 HYP 的生成 ，以及 mTOR mRNA 和 mTOR 蛋 白的表达量升高 ，其值接近 NS 对照组水平 ，在 7 d 或 14 d 时与百草枯模型组出现统计学差异 ，并持续 至 28 d 〔7 d ：HYP （μg/mg ）为 1.13 ±0.06 比 1.25 ±0.07 ；14 d ：HYP （μg/mg ）为 1.19 ±0.09 比 1.29 ±0.12 ，mTOR mRNA （2- ΔΔCt ）为 0.99 ±0.11 比 1.94 ±0.12 ，mTOR 蛋 白（灰度值 ）为 0.39 ±0.08 比 0.75 ±0.09 ；28 d ：HYP （μg/mg ） 为 1.28 ±0.06 比 1.40 ±0.05 ，mTOR mRNA（2- ΔΔCt ）为 1.15 ±0.13 比2.85 ±0.15 ，mTOR 蛋 白（灰度值 ）为 0.45 ±0.10 比 0.86 ±0.12 ，均 P ＜0.05 〕。结论 慢病毒介导 的 mTOR-siRNA 可有效抑制百草枯 中毒大 鼠肺组织 中 mTOR 表达