重组体的筛选和鉴定PPT.ppt

;8 重组体的筛选和鉴定;;;1 抗药性标记及其插入失活选择法;;;（1）四环素抗性基因 Tetr ：;选择过程：;;氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;;2.蓝白斑筛选法;假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。;β-半乳糖苷酶显色反应筛选法;;蓝白菌落;;噬菌斑(plaque);筛选植物转化细胞常用的报告基因;（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。;几种报道基因的作用原理;Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP;转入萤火虫的luciferase的烟草;GFP- Kac的狗 ;;④β-葡萄糖酸酶基因（GUS）;⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）;⑥抗除草剂bar基因;⑦冠瘿碱合成酶基因;在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（TK） -- 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） -- 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRT） ;真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。;胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。 这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有这些基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。 根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。 ;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;二、酶切电泳筛选法-物理检测法;;;三、PCR扩增检测法;1. 核酸杂交;二、核酸杂交检测方法;SouthernBlotting;- +;;;（1）原位杂交筛选;原位杂交筛选DNA重组体图解;;（2）R-环检测法;;2. Northern blotting;Northern Blotting;Western Blotting ;Southern和Western印迹法;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;2. 放射免疫测定法过程;;免疫化学法检测克隆在载体pUC8上的小鸡原肌球蛋白基因;滤膜;3. Broome-Gilbert双定位检测法;;二、免疫沉淀检测法;;三、酶联免疫吸附测定（ELISA）;;2. ELISA检测的一般步骤;加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;;在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。;3.ELISA的局限性;无细胞翻译系统;要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。;敏感；适于研究目的基因编码低丰度的mRNA;一般克隆与筛选策略