重组子的筛选与鉴定PPT.ppt

第六节 重组体的筛选与鉴定;外源DNA;;;;几种报道基因的作用原理;Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP;转入萤火虫的luciferase的烟草; 一、遗传检测法 报告基因筛选、 抗性标志插入失活筛选、 半乳糖苷酶蓝白斑筛选、 插入基因遗传性状筛选、 二、分子检测法 PCR扩增检测 分子杂交检测 三、物理检测法 DNA电泳检测 限制酶酶切分析法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析;一、遗传学检测法;重组体的筛选与鉴定筛; ;;（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。;pUC18/19; 载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，可编码β-半乳糖苷酶氨基端即α—肽链， IPTG可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端互补(α-互补)。 故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长形成蓝色茵落。 将一连串克隆位点克隆入质粒的lacZ基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。 利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。这种现象被称为是 ?-互补 X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 IPTG:(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷);;;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;;;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;根据重组DNA分子大小鉴定重组子 原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异。 基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。 此法是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，只适用于重组子的初步鉴定。;二、酶切电泳筛选法;二、分子检测法;PCR扩增检测法;例 PCR检测;转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株） ; ; 2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。;四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交 ;（1）菌落印记原位杂交筛选;;用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。;Paper Towels;2. Northern blotting; 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 ;带有DNA片段的凝胶;;。;真空转膜槽;;;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;;2. 放射性抗体检测法过程;3. Broome-Gilbert双位点检测法;;二、免疫沉淀检测法;;三、酶联免疫吸附测定（ELISA）;;2. ELISA检测的一般步骤;加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;;在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。;3.ELISA的局限性;临床检验常用的单抗;四、免疫印迹（western blotting）法;② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：;;③蛋白质电泳的分子量标准;;④凝胶中的蛋白质染色：;直接染色电泳结果;（2）Western blotting;Western装置;② Blotting;;1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。;④结果;一、无细胞翻译系统;二、转译筛选;三、杂交抑制转译法;2. 过程;四、杂交释放转译法;2. 过程;专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。;一般克隆与筛选策略;第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法;②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用;④胸苷酸激酶的补救作用;① HAT培养基：;;真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。;DHFR+细胞;DHFR- 细胞;② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救;DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。;③ 氨甲喋呤“加压” ;是细