重组体克隆的筛选和鉴定PPT.pptVIP

2. Northern blotting 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式： 一、放射性抗体检测法 第五节 免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 2. 放射性抗体检测法过程 二、免疫沉淀检测法 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 1. 原理 抗原——抗体凝集反应。 检测分泌型产物。 2. 方法 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理： 一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 19 2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 （2）一抗结合 一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 （3）二抗结合 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 （4）显色反应 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 （5）比色 四、免疫印迹（western blotting）法 1.原理： 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: （SDS）： ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。 ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液。 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 氨基酸平均分子量：110Da 银染 （2） Western转膜装置 * 第七章 重组体克隆的筛选和鉴定 转化子与筛选的概念 转化子(transformant)：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。 筛选(screening)：将重组体的转化子细胞或转染噬菌体群体从其它细胞群体中分离出来，并要鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因的过程。 筛选方法的类型 1. 直接筛选 根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，分为： 针对载体携带某种或某些选择标记基因（selectable marker genes）、报告基因（reporter gene）或目的基因而设计的筛选方法。 特点：直接测定基因或基因类型 2. 间接筛选 不要直接鉴定基因，而是利用其它方式，例如利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用，进行对重组体的筛选。 第一节 载体表型选择法 第二节 根据插入基因的表型选择 第三节 DNA电泳检测法 第四节 核酸杂交检测法 第五节 免疫化学检测法 第六节 转译筛选法 第七节 几种常见的真核生物重要基因选择方法 一、抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 第一节 载体表型选择法 1. 原理： pBR322 （1）四环素： （2）氨苄青霉素抗性基因： 2