结核分枝杆菌mRNA定量检测作为化疗监测指标的研究.ppt

结核分枝杆菌mRNA定量检测作为化疗监测指标的研究 结核病是除AIDS外引起死亡最高的感染性疾病，是严重的全球性健康问题之一。 结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段，成功化疗是患者治愈和限制TB传播的重要措施。 由于宿主体内不同生长菌群的存在以及机体本身对药物作用的反应性不同，有必要对结核病患者制定个体化的化疗方案及其疗效的早期、及时监控。这对确认化疗方案的合理性、及时修正化疗方案，对保证结核病化疗成功和阻断结核病传播至关重要。 目前，通常采用的化疗疗效监测手段是 涂片法和培养法 涂片法敏感性低、特异性差、死活菌不分 培养法受TB生长缓慢的制约，需时长 它们都难当早期预示疗效的重任 病例选择 治疗方案 痰标本的收集及前处理 涂 片 培 养 mRNA定量检测 总RNA提取及纯化 总RNA提取及纯化 RT反应 定量PCR 定量PCR反应在 ABI公司PE5700自动荧光定量PCR仪上进行。 标准曲线的制作：将已知数量的牛分枝杆菌DNA（85BDNA在牛分枝杆菌基因组中均是单拷贝存在）稀释成浓度为：108拷贝/ml、107 拷贝/ml、106 拷贝/ml、105 拷贝/ml 、104 拷贝/ml，各取5μl进行PCR反应，根据荧光反应的各自循环阈值（Ct）制作标准曲线。 定量PCR 定量PCR 其他观察指标 治疗前及在治疗2月后做药物敏感性实验。 治疗前、治疗2个月摄胸片，以断层片证实空洞是否存在。 痰标本结核分枝杆菌CFU结果 15例患者痰标本的CFU在治疗的2d与治疗前相比平均下降了0.73log10（下降了81%，)，治疗4d平均下降了1.41 log10，前4d的日平均下降速率是：0.35 log10，治疗7d时平均下降了2.21 log10，1例阴转，治疗14d平均下降了3.5 log10，4例培养阴性，治疗30d时培养阴转10例（阴转率为66.67%），治疗60d时15例患者全部培养阴性，60d的培养阴转率为100%。 痰标本85BmRNA检测结果 85BmRNA在治疗开始后的2d下降明显，平均下降2.29log10,（下降了99%，）与CFU的下降基本一致。治疗7d85BmRNA检测结果为阴性的11例（73.33%）,治疗14d85BmRNA检测为阴性的是12例（80%）,在治疗30d除1例为阳性外，其余均为阴性。治疗60d 85BmRNA检测均为阴性。 寻找化疗反应监测以及能预示化疗最终疗效的方法是相当复杂的。抗结核治疗的最终效果受到很多因素的影响：宿主的免疫状态、患者的依从性、药物的生物利用度、药物敏感性、感染的程度等等。所以评估一个患者对抗结核治疗的反应是复杂的、困难的。  由于本研究治疗前及治疗中未出现耐药病例，mRNA的变化如何反映耐药的出现问题，未能表现，是否存在由于利福平对mRNA的高效抑制而掩盖多药方案中出现耐药情况的可能还有待研究。 在过去的20多年，对化疗监测方法的研究进展甚微。X线的改变常常滞后于临床指征的改善，不适合作监测指标。多种血清学的指标能反映病变的活动性，但它们的临床应用价值还未能得到确认。最常用的监测手段是结核病患者痰标本中TB的消失，即几十年来人们一直沿用的细菌学方法。涂片的敏感性依赖于患者的病变程度、操作者的技术等等，一般在22～80%，特异性受到其他非结核分枝杆菌和死菌的限制。痰培养法在灵敏度和特异度上优于镜检法，但由于受TB生长缓慢的制约，1～2个月才能报告结果，难以满足早期监测的目的。 A B 以DNA和rRNA为靶点的分子标记物的检测由于存在长度不等的平台期，不能作为化疗监测的指标。根据结核化疗反应的目的和特殊要求，我们在前期工作的基础上，进行了患者痰标本中结核分枝杆菌mRNA分子的检测实验，以寻找化疗的监测方法。 实验结果显示：15例患者痰标本中TB 85BmRNA 在治疗的2d快速下降，12例（73.33%）在治疗14d转阴，治疗30d时仅1例为阳性，60d时检测结果全部为阴性，表明：mRNA分子是与活性结核分枝杆菌的存在直接相关，是活菌数量快速下降的反映，是对化疗药物治疗有效的反映。 将定量RT-PCR方法应用于接受治疗的肺结核患者痰标本中TB的检测关键在于标本的收集与处理方法，RNA的提取质量以及荧光定量PCR的采用等等。患者痰标本中TBmRNA的早期、快速的化疗反应评估对化疗方案的及时修正非常重要尤其在耐药结核病日趋增加的情况下。抗结核治疗需要新药，抗结核新药的临床评价因抗结核治疗的疗程长，而需时较长，TBmRNA在患者痰标本中的快速消失，用于新药、新化疗方案的快速评价将大大缩短实验周期，很有实用意义。 本实验15例患者痰标本中TB85BmRNA在治疗的2d下降了99%（ 2