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Twist 基因表达下调对 Caski 细胞增殖的影响研究研 究 生：文丹导师：孙 晓 红 副教授 摘要目的采用 RNAi 方法，成功构建针对 Twist 基因具有特异性的 Twist-siRNA,，瞬 时转染 Caski 细胞，观察分析 Twist 基因表达下调后对 Caski 细胞增殖的影响， 阐明 Twist 基因在 Caski 细胞中的作用，为治疗宫颈癌提供新的基因治疗靶点。 方法以人 Caski 细胞作为实验对象，由 RT-PCR 检测 Caski 细胞中 Twist mRNA 表达情况；实验分为五组，即①siRN A 组；②siRNA B 组；③siRNA C 组；④阴 性对照组⑤空白对照组〔未经转染的与①组、②组和③组具有相同遗传背景和代 数的 Caski 细胞〕，由 siTran 1.0 Transfection Reagent 介导下瞬时转染 Caski 细胞， 48h 后分别检测各组细胞 Twist mRNA 和 Twist 蛋白表达水平，通过两者表达水平 筛选出具有最高沉默效果的片段。用筛选出片段在 siTran 1.0 介导下瞬时转染 Caski 细胞，分别于 24h、48h、72h、96h 检测实验各组细胞 Twist mRNA 和蛋白 表达水平，MTT 检测 24h、48h、72h 实验各组细胞 A 值（吸光度值），分析细胞 增殖情况。结果1．Twist 基因在 Caski 细胞中存在表达。2．PCR 结果显示：阴性质粒转染组和对照组比较差异无显著性，si RNA A 转 染组、 siRNA B 转染组、siRNA C 转染组和阴性质粒转染组比较差异有显著性（P0.05）, siRNA A 转染组、siRNA B 转染组、siRNA C 转染组对 Twist mRNA 的 抑制率为分别为 28%、74%、43 % ,siRNA B 转染组最有抑制效果，适合用于下一 步实验。3．Western blot 结果显示：阴性质粒转染组和对照组比较差异无显著性，si RNA A 转染组、 siRNA B 转染组、siRNA C 转染组与对照组和阴性质粒转染组2比较有显著性差异（P 0.05）, 实验各组中以 si RNAB 转染组蛋白水平表达最低，其抑制率约为 77 %。4.同空白组相比,Twist mRNA 和蛋白表达水平在转染后 24h、48h、72h、96h时均下降，各实验组 Twsit mRNA 表达水平分别是 0.88±0.04、0.86±0.02、0.65±0.02、0.78±0.04、0.72±0.04（p 0.05）；各实验组 Twsit 蛋白水平表达分别 是 0.95±0.03、0.86±0.02、0.58±0.04、0.88±0.01、0.90±0.02（p 0.05）。5.MTT 结果显示：siRNA B 转染组与未转染组及阴性对照组细胞相比 Caski 细胞增殖能力显著降低, 24h、48h、72h 抑制率分别为 14.1 %、29.3 %、26%，沉 默 Twist 基因可以有效地抑制 Caski 细胞的增殖能力。结论1. 成功构建 Twist-siRNA，并有效下调 Caski 细胞中 Twist 基因表达。2. Caski 细胞下调 Twist 表达，可抑制 Caski 细胞的增殖能力。关键词：宫颈癌；Twist 基因；细胞增殖 ；3The downregaulated of Twist gene on the influence of human Caski cell proliferationABSTRACTObjectivesWe used RNAi methods，It was successfully constructed for Twist-siRNA what has targeted，Twist-siRNA were transfected into Caski cell，To observe and analyzeCaski cell proliferation, after the downregulated of Twist gene The role of Twist gene be elucidated in the Caski,，it will provide a new gene therapeutic targets for the treatment of cervical cancer..MethodsCultivate human Caski cell in vitro. The expression of Twist mRNA was detected by RT-PCR in cervical cancer Caski cell.