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过表达 PSMB5 抑制人骨髓间充质干细胞衰老进程摘要目的：探究 20S 蛋白酶体 β5 亚单位（PSMB5）在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)衰 老进程中的影响，旨在揭示蛋白酶体活性对细胞衰老的影响，为延缓细胞的衰老 指出一条可行性策略，以期为干细胞临床治疗研究提供新的思路。方法：分别构建 PSMB5 与绿荧光蛋白（GFP）融合表达的慢病毒载体感染体外培养 晚期的 hBMSCs，并依照感染病毒的不同将细胞分为 PSMB5 实验组和 GFP 对照组。 1.通过 Real-time PCR 和 Western bloting 验证 PSMB5 过表达效率。2.应用荧光分光 光度法检测 20S 蛋白酶体活性。 3.利用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）免疫荧光染色 观察增殖情况，通过 Western 来检测细胞周期相关的蛋白：P21、Cyclin D1、CDK4 的表达变化。4.应用 SA-β-gal 染色法观察 hBMSCs 衰老情况。5.在培养基中加入不 同浓度（0 μM、50 μM、100 μM、200 μM、300 μM、400 μM、500 μM、600 μM） 的 H2O2，形成氧化损伤环境加速细胞衰老，探讨氧化环境对细胞损伤、衰老的影 响，应用 CCK-8 法测定氧化应激条件下 hBMSCs 的细胞活性。结果：1. Real-time PCR 结果显示 PSMB5-mRNA 水平亦较 GFP 组显著提高 5.24 ±0.22 倍（P0.01），同时 20S 蛋白酶体其余亚单位 PSMB1、PSMB2、PSMB6 的 mRNA 水平变化无统计学意义；Western bloting 结果显示 PSMB5 基因过表达后在实验组 中 PSMB5 蛋白表达水平约为 GFP 组的 2.70±0.19 倍（P0.01）。2. PSMB5 组中 20S 蛋白酶体活性升高，相较 GFP 组为 1.55±0.21 倍（P0.05）。3. 在 BrdU 免疫荧光 实验中，PSMB5 组的 BrdU 阳性细胞数为 37.91%±1.82%，而 GFP 组阳性细胞数 为 28.18%±1.98%（P0.01）。免疫印迹检测提示 PSMB5 组中细胞周期相关蛋白表达水平较 GFP 组明显上调，P21 上调 1.45±0.05 倍（P0.01）、Cyclin D1 上调 1.56±0.16倍（P0.01）、CDK4 上调 1.23±0.06 倍（P0.05）。4. SA-β-gal 染色结果显示 PSMB5 组中衰老阳性细胞数 40%±3.7%较 GFP 组的 55%±3%偏低（P0.01）。5. CCK-8 法 检测细胞活性检测结果表明，细胞活性与 H2O2 浓度之间存有一定的依赖性， hBMSCs 的细胞活力会随 H2O2 的孵育浓度升高而降低（P0.01）；而在相同的 H2O2 浓度下，PSMB5 组中 hBMSCs 具有较高的细胞活性，其中当 H2O2 的孵育浓度为 300 μM 时的 OD 值之比约为 2.11±0.23 倍（P0.01），而当浓度为 500 μM 时，两 组间没有统计学意义；测定当 H2O2 的孵育浓度为 300 μM 时 20S 蛋白酶体活性的 结果发现 PSMB5 组中 20S 蛋白酶体活性升高，相较 GFP 组为 1.37±0.12 倍（P0.01）。 说明在氧化应激的条件下，PSMB5 过表达可以保护细胞活力，防止细胞衰老。结论：1.过表达 PSMB5 可以增强 hBMSCs 20S 蛋白酶体活性，提高细胞增殖能力， 延缓衰老。2.氧化环境中，过表达 PSMB5 可以保护 hBMSCs 因氧化应激产生的损 伤，使细胞仍保持较高的活性，抑制了细胞衰老进程。提示 PMSB5 可能是抑制细 胞衰老提高细胞活力的重要靶点。关键词：人骨髓间充质干细胞；PSMB5；衰老；蛋白酶体Overexpression PSMB5 prevents senescence of human bone marrow stromal cells in vitroAbstractObjective:To observe the role of 20S proteasome subunit beta 5 (PSMB5) in prevents senescence of human bone marrow stromal cells (hBMSCs) in vitro, and confirm the role of the 20S proteasome activity changing in the aging process, which would further looking out a feasible strategy to in