口蹄疫病毒RNA复制酶基因3D的克隆、表达及纯化.pdfVIP

中国兽医学报 2005年3月第25卷第2期 C^跏t，y以SfiMar．2005V01．25No．2 119 口蹄疫病毒RNA复制酶基因3D的克隆、表达及纯化 孙 涛，陆 苹 (上海交通大学农业生物技术学院生物技术研究所，上海201101) 重组质粒在大肠杆菌中表达后的目的蛋白为可溶性形式，纯化产物用感染A型FMDV的豚鼠康复血清进行west— ern-blotting检测，结果表明，3D基因得到了正确的表达。 关键词：口蹄疫病毒；RNA复制酶基因；表达 中图分类号：S852．65 文献标识码：A 文章编号：1005—4545(2005)02一0119一03 口蹄疫病毒(FMDV)属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，医研究所；增殖病毒用BHK21细胞，购自上海细胞生物学研 其基因组为一单链正义RNA，可行使类似mRNA的功能。口究所，并由本实验室传代。大肠杆菌表达载体pET一32a(+)， 蹄疫病毒RNA复制酶由FMDV3D基因编码，它是一种 大肠杆菌TGl、BL21(DE3)，均由上海生物化学研究所吴祥 RNA依赖的RNA多聚酶(RdRp)，即以RNA为模板，合成1 条与RNA(+)链互补的RNA(一)链，然后以这条负链为模 DNA 板再合成病毒基因组RNA，从而完成病毒RNA复制过程。公司生产；dNTP、T4 这类酶介导的复制过程无纠错功能，它是造成RNA病毒高 BBI产品；DAB，为F1uka产品。 突变几率的原因之一。目前国外对同属小RNA病毒科的脊 1．2 FMDv的增殖及RNA的提取将长满BHK21细胞的 髓灰质炎病毒以及黄病毒科的丙肝病毒的RNA复制酶的蛋 方瓶内的细胞培养液倒去，接种。型FMDV，感作1h以后， 白空间结构和生物化学特性进行了一些研究u”o，但对 弃去病毒液，加入含2％小牛皿清的RPMll640培养液，12～ FMDV则研究较少。由于病毒增殖过程中表达的天然3D蛋18 000 h后，收集含病毒的细胞培养液，反复冻融3次，10r／ 白量少，难以提供大量的蛋白供研究之用，因此我们以Gen— ooO min离心30min，弃沉淀，上清以30r／min离心2h，收集 Bank中报道的FMDV株序列为参考，设计引物扩增并克隆 沉淀，冻存于一70C。 了FMDV3D基因，并在大肠杆菌中进行了表达，得到了大量 较高纯度的FMDV3D重组蛋白，从而为进一步的研究打下 试剂盒所述方法进行。病毒RNA用无Rnase的去离子水溶 了基础。 解后，立即进行反转录反应。 FMDv 1．3 RNA复制酶基因3D的扩增、克隆以Gen— 1 材料与方法 Bank中报道的FMDV株序列为参照，设计引物扩增FMDV 3D基因。上游引物(含BamHI酶切位点)，5’CGCGGA 1．1材料感染A型FMDV的豚鼠康复血清，购白兰州兽 TCCGGGTTGATTGTTG3’；下游引物(含HindⅢ酶切 7 收稿日期：2003一11一03 位点和终止密码子)，sATCCCAAGCTTTcATGCG 作者简介：孙涛(1968一)，男，副研究员，在读博士。 CCGCAC