昆虫抗性监测与治理-幻灯片.pptVIP

抗性早期诊断技术 在通常情况下，在田间防治失效时，抗性已是比较高了，只能换用无交互抗性的杀虫剂。抗性治理只有在抗性基因频率较低时才有效，所以必须对抗性种群进行抗性监测。 3. 抗性早期诊断技术 区分剂量（discriminating dosage）技术 首先获得该虫种的SS个体，即敏感纯合子品系，对某种杀虫剂的敏感度基线(base-line data)，然后用该品系的LC99.9(或LD99.9)的剂量处理，存活的个体即为RS和RR个体。该方法的缺点是：①要通过遗传杂交的方法来纯化品系，较繁琐、费时；②难以真正完全区分RS和RR个体；若RS呈隐性，则无法将SS和RS分开；③无法了解其抗性机理。 3. 抗性早期诊断技术 F1代与SS(曲线a)或与RR(曲线b)回交后的分离情况 “a” 具有典型的1:1分离，“b”没有明显的诊断剂量 3. 抗性早期诊断技术 基于酯酶的测定方法(1) 应用高效液相层析(high-performance liquid chromatography, HPLC)测定单个蚊虫的酯酶活性。酯酶水解模型底物?-醋酸萘酯为醋酸和?-萘酚，后者与染料固蓝盐B反应生成一种蓝紫色物质(λ=550~600 nm)，用分光光度测定，以其光密度为酯酶活性。Pasteur和Georghiou（1989）根据这个原理，发展了测定单个昆虫的酯酶滤纸快速测定法。即取单个昆虫匀浆液（磷酸缓冲液）少许，点滴于滤纸上（在此滤纸为携酶的载体），然后浸入含有?--醋酸萘酯（底物）的磷酸缓冲液1 min后取出，再浸入含有显色剂的染色液，晾干后对色斑的大小和强度进行测定和比较。 3. 抗性早期诊断技术 微量滴度酶标板法（microtiter plate assay）测定了单个烟芽夜蛾幼虫的酯酶活性。测定底物为以对硝基苯乙酸(p-nitrophenyl acetate, PNPA)。酶液制备：取单个幼虫中肠，加500?L匀浆缓冲液，用Polytron匀浆10 s。然后进一步匀浆(1000 g, 2 min)，上清液为酶源。酶源以1:150比例用0.1 mg/L磷酸钠缓冲液(pH 7.6)稀释，保温液含100 ?L稀释的酶液和0.5 mmol/L PNPA,最终容积为200 ?L。应用Thermomax微量滴度板酶标仪在30℃， 405 nm处进行检测。每15 s测定一次反应，总共测定15 min保温期。 用96孔酶标板为载体，依次在每孔穴中加入一定量的底物（?-醋酸萘酯）和单个昆虫的酶液，在室温保温30 min后，加入显色剂，置于便携式酶标仪下对96孔板读数（microtiter plate assay）。 上述的2种方法的优点是能快速、准确地测定与酯酶活性增高相关的抗性个体。缺点是无法区分由酯酶性质改变而引起的抗性。  基于酯酶的测定方法(2) 3. 抗性早期诊断技术 基于P450单加氧酶的(微量)滴度酶标板测定方法 应用对硝基茴香醚（p-nitroanisole，PNA）或甲氧基试卤灵（methoxyresorufin，MRR）作为P450加氧酶的底物。酶液制备用单个昆虫中肠在500 ?L匀浆液中匀浆10 s，然后离心（1000 g, 2 min），上清液作为酶源。保温液为75 ?L匀浆液，10 ?L NADPH再生系统[0.25 mmol/L NADP+、2.5 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、1个单位葡糖-6-磷酸脱氧酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD）]和1~5 mmol/L PNA，最终体积为200 ?L。然后用Thermomax微量滴度酶标板读数仪在30℃，405 nm测定 3. 抗性早期诊断技术 基于GST的快速测定法 GST活性生化测定比较复杂，而且要用分光光度计等仪器才能测定。最近Vontas等（2000）发展了一种简便的定量测定的GST活性的方法，也可用于单个昆虫的测定。在测定中应用GSH和CDNB在一个固定时间内获得线性的酶反应后，在化学计量上应用碘(滴度)法（iodometric titration）测定游离的GSH，最后从不同的颜色范围获得测定结果。即用碘的滴度来测定GSH。用淀粉作为内指示剂，因为在淀粉溶液中碘化汞抑制GST活性，终止酶反应。 Brogdon和Barber(1990)应用微量滴度板测定了单个蚊虫的GST活性。 3. 抗性早期诊断技术 基于乙酰胆碱酯酶的测定方法 以模型底物乙酰硫代