病理学常用研究方法(研究生课程)教学教材.pptVIP

* * * * * * * * * * 病理学常用研究方法 主讲人：王恩华 整体水平： 尸体解剖 autopsy 动物实验 animal experiment 细胞水平： 光镜组织切片 light-microscope 细胞培养 cell culture 流式细胞技术 flow cytometry 组织芯片 tissue micro-array 组织微切割技术 micro-dissection 电镜 透射、扫描、免疫电镜 蛋白水平： 1.免疫组化 immunohistochemstry 2.Western Blotting 3.组织芯片 tissue micro-array 基因水平： 1.原位分子杂交(组织、染色体Fish) in situ hybridization 2.基因芯片 gene chip 3.组织芯片 tissue micro-array 4.PCR及测序等 PCR and sequence 一、免疫组化标准化问题探讨 本世纪70年代问世 抗体种类急速增加，交叉反应存在 免疫组化技术方法不断问世 使用的试剂或实验室条件不同 操作人员的熟练程度 病理医生的结果判定水平及关联知识 解决标准化的问题势在必行 (一)方法的选择 目前常用的免疫组化方法有： PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等 各种方法只要运用得好，都会得到满意 的结果 建议：在我们省内都采用S-P法 S-P法的优点 ① 方法统一 ② 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 ③ 一般2-3小时(30’-60’)，而ABC法需1天，分 子量小(60KD)，穿透力强 ④ 灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生 物素结合，而且结合键强 ⑤ 背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于 中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10 S-P法与ABC法的区别 S-P法：Streptaridin peroxidase conjugataed method 链霉菌素抗生物素蛋白——过氧化物酶连接法ABC法： Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素亲生物素——过氧化酶复合物法 S-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素 即：卵白素中的4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结 合，另一方面还与复合物中的生物素结合 一抗 二抗 卵白素 生物素 过氧化物酶 A------B-------C 一抗 二抗 链菌素抗生物素蛋白 过氧化物酶 ABC法： S-P法： (二) 固定、包埋 固定液：一般10%中性缓冲福尔马林，PH7.3-7.4(PBS配制) 固定时间：应少于24小时，固定时间越长，抗原丢失越多 固定液量或组织块大小：组织为1/3，固定液2/3 大体标本：切下一块固定 包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在65℃以下 (三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原) 组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性 其原因是： ①固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋白抗原发生了交联，形成网络 ②固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原 抗原修复的目的： 就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种： 只限于需要抗原修复的抗体 ①热 微波 高压锅 水浴锅 ②酶消化 胰蛋白酶 胃蛋白酶 2. 扩增： Total: 25μl ① PCR buffer 2.5μl ② mixed dNTP 2.0μl ③ dH2O 16.375μl ④ primer 1 1.0μl primer 2 1.0μl ⑤ Taq 0.125μl ⑥ DNA template 2.0μl 94℃ 25” → 55℃ 25” → 72℃ 40” 30 cycles 3. Agarose 2-5%，用1×TBE电泳 ①扩增后液 5μl + 1μl loading buffer ②溴化乙淀染色 20’，UV照射下确认泳带→照相 4. DNA收集 RECOCHIP法 三、Western Blotting 1. 提取蛋白 ①500μl的hypotonic