08 免疫组化双重染色技术PPT.pptVIP

第八章. 免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry) 用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两种以上的抗原, 以发现其定位, 形态和功能上的相互关系. I. 连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切片上各自显示一种抗原, 然后比较. 不会互相干扰或出现假双标. B. 切片厚度1~3?m, 否则不能确保双阳性结果. 神经组织切片10~20?m, 可采用“镜像”法 即相邻切片翻转后贴在载玻片上, 软件PS处理. II. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体, 显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~5→520~30nm, 绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)或其他荧光染料分别标记的两种一抗混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片. 3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞(呈绿色或红色). 如果两种抗原存在于同一个细胞或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色. Alexa Fluor 488-1st antibodies shows EEA1, Alexa Fluor 568-1st antibodies shows beta-tubulins. Cultured 18-embryonic day rat hippocampal neurons.. B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自不同种属的动物如兔和豚鼠(Guinea pig). 2. 两种来源于同种动物或不同种动物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记. 3. 染色步骤: a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第二种抗原. 或者将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后孵育切片. b. 其余同前. COS7 cells, Y.W Lin. Nuclei were stained by Hoechst blue, USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594. Mixed color is yellow. Alexa Fluor 568-2nd anti-giantin in G, Alexa Fluor 488-2nd anti-NPCP, Alexa Fluor 350-phalloidin. Tahr Ovary Epithelial Cells (HJ1.Ov Line). Texas red- 2nd anti-insulin, FITC-2nd anti glucagons in mouse pancreas. III. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 常见于两种一抗来自同种属动物. 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电子供体如DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶(步骤a)及其反应产物从组织上洗脱(步骤b). c. 连续做两次染色, 所费时间较长. 假性双标的来源 第一次用ABC法染色, 氧化法洗脱抗体. 对照试验证实此为假性双标. 1992. 2. 抗体洗脱法: a. 酸洗法: 在pH2.2甘氨酸(Glycine)-HCl缓冲液中加入适量二甲基甲酰胺(Dimethylfomamide, DMF), 作用1~4小时使抗原-抗体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧化除去抗体, 0.5%偏重亚硫酸钠 (Sodium Metabisulfite, Na2S2O5)漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种抗原的影响(可设立对照). c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位. 3. 步骤: a: 第一次染色后, 除去抗体和酶而使有色反应终产物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及NGS封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, C