3 免疫组织化学技术概述 12-9-1PPT.ppt

免疫组织化学技术概述; 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或 细胞标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进 行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组 织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞 化学（immunocytochemistry）技术。;（一）免疫细胞化学/称免疫组织化学原理: 通过特异的抗原、抗体（标记上可见的显示物）反应系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。 此方法可以识别定位各种细胞组织成分， 如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌、病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等，一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。 ;抗原 (antigen, Ag)  抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反 应的物质，称为抗原。 抗原具有两个方面的特性： 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋巴细胞的特性； 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特 异的结合或反应的特性。  根据抗原是否显示免疫原性分为：  -完全抗原; -半抗原: 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。;抗体 (antibody, Ab) /experiment/16-2014-1.html 概念：机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有 与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。  抗体主要存在于血清内, 抗体都是免疫球蛋白， 分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。  免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。  单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细 胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。  多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物 血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生 的抗体混合物。 ;抗体制备： ——多克隆抗体的制备  *动物的选择  *佐剂(adjuvant)  *免疫方法  *免疫剂量  *抗体效价的测定  *放血或定期抽血 ;;抗原修复 原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：  -抗原性物质形成醛键、羧甲键致使部分抗原决定簇被封闭； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，使固定时分子 之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 ;抗原修复——方法 化学方法: 消化。胰蛋白酶、胃蛋白酶、Laminin、CollagenIV 加热方法：水浴加热法、微波照射法、高压加热法、酸水解法 水浴加热法：*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至 沸腾，持续10～15分钟。 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。 微波照射法：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波 炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫 组化染色步骤进行。 高压加热法暴露抗原： 将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压 ;（二）免疫组织化学染色方法 按染色步骤 直接法(又称一步法) 间接法(二步、三步或多步法) 按标记物质的种类 如荧光染料免疫荧光法 放射性同位素放射免疫法 酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)酶标法 铁蛋白、胶体金免疫金银法。 按结合方式 抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法 亲和连接：如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、 ** 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等;一、直接法? 用标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结 合，使标记物沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进 行定性、定位以至定量研究。 ;直接法 1．检查