苹果MxNas1基因转化番茄突变体‘Chloronerva’的研究.docVIP

苹果MxNas1基因转化番茄突变体Chloronerva’的研究 　　摘要：将前期构建好的含苹果属小金海棠ＭｘＮａｓ１基因的正义表达载体ｐＢＩ１２１－ＦＮａｓ转化了番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ，从不同激素配比、筛选压梯度、侵染菌液的稀释浓度、侵染时间和酚类化合物等几方面对转化条件进行了优化。结果表明，培养基激素配比ＺＴ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ ０．２ ｍｇ／Ｌ，菌液稀释１０倍，农杆菌侵染５ ｍｉｎ，卡那霉素的选择压力浓度为５０ ｍｇ／Ｌ条件下，大部分外植体还保持绿色，不定芽的分化较好，番茄子叶外植体的抗性芽生成率高达２５％以上，是番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ适宜的转化条件。通过对转基因番茄的表型鉴定，转化后的不同番茄株系均能很好地互补突变体的表型，即叶脉和脉间出现了复绿现象，初步证明了ＭｘＮａｓ１基因在植物铁代谢中的作用。 　　关键词：苹果属小金海棠； ＭｘＮａｓ１基因； 番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ； 遗传转化 　　中图分类号：Ｓ６６１．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－1049-04 　　 　　Study on Transformation of Tomato Mutant Chloronerva’ with MxNas1 　　Gene of Apple 　　 　　ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｇａｎｇ１，ＨＡＮ Ｚｈｅｎ－ｈａｉ２ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＭｘＮａｓ１ ｇｅｎｅ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｉｎｔｏ ｔｏｍａｔｏ ｍｕｔａｎｔＣｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ， ｆａｃｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｏｆ ＺＴ， ６－ＢＡ ａｎｄ ＩＡＡ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｎ， ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔｙｌｅ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ＺＴ ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ ０．２ｍｇ／Ｌ， １０－ｆｏｌｄ－ｄｉｌｕｔｉｏｎ， ５－ｍｉｎｕｔｅ－ｉｎｆｉｌｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｋａｎ ５０ｍｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ２５％． Ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ＭｘＮａｓ１ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｒｅｓｃｕｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｔｏｍａｔｏ ｍｕｔａｎｔ Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒva， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ that ｉｔ ｗａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＮＡ ｓｙｎｔｈａｓｅ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍａｌｕｓ ｘｉａｏｊｉｎｅｎｓｉｓ； ＭｘＮａｓ１ ｇｅｎｅ； ｔｏｍａｔｏ ｍｕｔａｎｔ Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ； Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ 　　 　　在高等植物中，尼克烟酰胺是一种较强的金属离子螯合剂，不但螯合Ｆｅ，而且螯合Ｆｅ［１］。ＮＡＳ作为在高等植物中普遍存在的一种酶能催化３分子的ＳＡＭ缩合形成尼克烟酰胺［２］。近年来，ＮＡＳ基因也相继在大麦［３］、水稻［４］、玉米［５］、拟南芥［６］、番茄［７］上被克隆。ＮＡ被认为在植物体内铁的运输及内源平衡中起重要作用［８］。这一点可以在番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ上得到证实［７］，番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ因其ＮＡＳ基因的缺失突变而不能正常地合成ＮＡ，尽管土壤中存在大量铁，仍然表现为典型的缺铁症状，即幼叶出现脉间黄化现象，使用外源ＮＡ能够使突变体恢复到野生型。作者前期以小金海棠为试材，构建了缺铁胁迫条件下小金海棠的消减ｃＤＮＡ文库［９］，并从文库中克隆得到了小金海棠尼克烟酰胺合成酶基因ＭｘＮａｓ１［１０，１１］，将其转化到番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ中。为了获得较高的转化效率，本文对转化体系进行了优化，并对转基因株系进行了表型鉴定，为进一步研究ＭｘＮａｓ１基因的功能打下了基础。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　番茄突变体Ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ种子由中国科学院遗传与发育生物学研究所凌宏清教授惠赠。种子播种于基质中，当接穗和砧木长出２～３片真叶、下胚轴直径２ ｍｍ左右时进行嫁接。嫁接苗经锻炼后移栽至中国农业大学科学园温室大棚内，待果实成熟后采摘，取其种子洗净后晾干保存。 　　１．２质