试验一考马斯亮蓝G-250染色法蛋白质定量.PPTVIP

【实验目的】 学习掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，在一定范围内，溶液在595nm 波长下的吸光度值与蛋白质的浓度成正比。因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1μg蛋白质。 特点： 1、染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。 2、一定范围内,溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。 3、一些阳离子，如K+、Na+、Mg 2+、（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，但去污剂如Tritonx-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照消除。 优点： 试剂配制简单、操作简便快捷、灵敏度高、重复性好、显色迅速、干扰物质较少。 测定范围1-100μg。 【实验仪器及试剂】 1、仪器： 722分光光度计、天平、试管、 移液管（吸量管）、 离心机 2、试剂： （1）标准牛血清蛋白质溶液（ 100 μg/mL ）： ( 每实验台配制20ml ) ①???配制牛血清蛋白质储存液（250μg/mL）： 称取牛血清蛋白25mg，加生理盐水溶解并定容至100mL。 ②??吸取上述溶液40ml，用蒸馏水定溶至100mL。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液： 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL　90%的乙醇中，加入100mL 85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。 （3）生理盐水： 称取0.9g NaCl 加蒸馏水至100ml。 【实验步骤】 1．组织样品的制备： 准确称取新鲜样品0.5g，用5mL生理盐水在冰浴中研成匀浆。在3500rpm离心10min，取上清液待测。 2. 血清样品的稀释： 取血清 250 μl，加生理盐水至 50ml. 表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 待测 标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1 （100 μg/mL） 生理盐水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.9 G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg) 0 20 40 60 80 100 吸光度值 结果处理： ①利用标准曲线，求得待测样品蛋白质浓度。 待测样品蛋白质浓度μg／ml＝待测样品浓度×稀释倍数 ②利用公式法计算待测样品蛋白质浓度 ③利用计算器计算待测样品蛋白质浓度 【注意事项】 1、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收。 2、测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 3、溶液不要地到分光光度计上。 * * 实验一 考马斯亮蓝G-250染色法测定 蛋白质含量 *