蛋白质免疫印迹技术及常见问题PPT.ppt

免疫印迹技术的基础-免疫反应; Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析; 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。; 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析;Western Blot 流程;通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 ;蛋白样品的定量;不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 ;凝胶成分;凝胶浓度与蛋白分离范围;转膜;湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 ;丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 ;转膜后的封闭; 一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。;二抗与底物反应显色;应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体; Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析;Western blot常见问题—SDS电泳;条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？;凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ ;蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚;膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高;抗体保存不当 抗原不充足 膜的??洗过度;一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合;分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白 ;TIANGEN产品结构—底物显色液;HRP-DAB底物显色试剂盒Western blot中的应用;Pro-light HRP 灵敏度检测试验;Toll-free: 800-810-2177