14 免疫学检测技术PPT.ppt

分子生物学检测法优点：特异性高。 分子生物学检测法缺点：仅能检测CK基因表达情况，不能直接提供CK含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究CK基因表达与调控。 四、黏附分子的检测 （一）细胞膜表面AM检测 1、间接免疫荧光法——组织细胞表面AM 组织切片标本+抗AM单抗+羊抗小鼠IgG荧光抗体，进行间接免疫荧光染色，借助荧光显微镜观察表达AM的阳性细胞数。 2、间接酶免疫组化法——组织细胞表面AM 组织切片标本+抗AM单抗+羊抗小鼠IgG酶标抗体，加入酶底物显色，显微镜观察表达AM的阳性细胞数。 3、流式细胞术——内皮、淋巴细胞等表面AM 待检细胞悬液+两种荧光素标记单抗，在流式细 胞仪上可同时检测胞膜表面两种不同的AM。 （二）可溶性AM测定 1、ELISA双抗体夹心：最常用于检测选择素家族和免疫球蛋白超家族成员。 2、其他免疫测定方法：RIA或IRMA、化学发光免疫测定、时间分辨荧光免疫测定方法等 第三节 免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离与纯化 （一）白细胞的分离 1、自然沉降法 2、高分子聚合物加速沉降法 （二）外周血单个核细胞（PBMC）的分离 1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F-H）密度梯度离心法 2、Percoll密度梯度离心法 （连续和不连续） （三）淋巴细胞的纯化与亚群分离 1、去除红细胞 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化 铵处理法。 2、去除血小板 离心洗涤或胎牛血清（FCS）梯度离心法， 因FCS可让单个核细胞通过，而阻止血小板通过。 3、去除单核细胞和粒细胞 （1）黏附法 玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱，清 除发生黏附的细胞 （2）羰基铁粉吞噬法 单核细胞吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至 管底 （3）苯丙氨酸甲酯法 苯丙氨酸甲酯具有亲溶酶体性质，用该法可溶 解含溶酶体的细胞（如单核、粒细胞等）。 4、淋巴细胞亚群的分离 （1）E花环分离法 T细胞表达SRBC受体，能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心，可将T、B细胞分离。 （2）尼龙棉柱分离法 B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不易黏附，借此可将T细胞与B细胞分离。 （3）亲和板结合分离法（洗淘法） 直接结合法：抗体包被塑料平皿或细胞培养瓶 （板）+细胞，吸附表达特定抗原的细胞。 间接结合法：包被抗小鼠IgG抗体（第二抗体）+与单抗结合的淋巴细胞，被吸附固定而分离。 特异性抗原（配体）包被+表达相应受体的细胞，该细胞被分离。 优点：可同时进行细胞的阳性分选和阴性分选，且所获细胞量较大。 缺点：亲和板结合分离法一般适合进行阴性分选。此外，包被的抗体宜采用不含Fc段的（Fab’）2抗体片段，以免发生非特异性吸附。 （4）补体细胞毒分离法 抗体+细胞+补体，通过补体依赖的细胞毒作用（CDC）而清除相应细胞，用于细胞阴性分选。 （5）流式细胞术分选法 直接法：将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（IMB），其可与表达相应膜抗原的细胞结合；应用强磁场分离IMB及其所吸附细胞，从而对特定细胞进行阴性或阳性分选。 间接法：用抗小鼠IgG抗体（第二抗体）包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（一抗）的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。 （6）磁性激活细胞分离器（MACS）分离法 MACS分离法优点： 所获细胞纯度高（93%~99%），获率可达90%，活细胞率＞95%；分离效果可与流式细胞术相媲美，但比后者省时且费用低，操作简单。 缺点：阳性分选中，抗体可导致细胞活化或细胞凋亡。 （四）单核-吞噬细胞分离和收集 1、将PBMC通过Percoll连续密度梯度离心法或洗淘法（阳性分选）可获取单核细胞，但所得细胞数量较少。 2、斑蝥敷贴法可以从组织渗出液中获得数量较多且较纯的巨噬细胞，亦无需作进一步分离。 3、以灭菌巯基乙醇酸盐肉汤培养基（或无菌液体石蜡）注入小鼠腹腔内，引起无菌性炎性渗出，从腹腔冲洗液中可获得大量巨噬细胞（＞85%）。 二、淋巴细胞及其亚群检测 （一）T细胞检测计数 1、间接免疫荧光法 应用抗CD3/CD4/CD8单抗与PBMC结合，再加入荧光素标记的抗小鼠IgG抗体（第二抗体），在荧光显微镜下观察并计数。 2、酶免疫组化法 1）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）法； 2）ABC法（间接法） 细胞涂片+单抗+二抗-B+AB*C+底物显色 3、流式细胞术 采用流式细胞仪计数 4、免疫金银染色法（IGSS） （二）B细胞检测计数 1、膜表面免疫球蛋白（mlg）检测 细胞涂片+荧光素标记抗Ig抗体（免疫荧光法）/+酶标记抗I