临床样本的采集、运输和保存及核酸提取PPT.pptVIP

临床标本的采集、处理、运送与保存及DNA/RNA提取 ;研究背景;研究背景;临床标本的正确采集、运送、保存的重要性;（一）、样本的采集;标本采集的注意事项;血清（浆）;肝素的作用机理 ;（二）、样本的运送 ;（三）、样本的保存;研究背景;核酸提取的重要性;（一）、提取核酸总的原则;（二）、核酸提取的基本步骤;各种组织细胞破碎方法;2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液;3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤; 4. 核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定;浓度鉴定;RNA：;2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）;EB与DNA的结合 ;纯度鉴定;完整性鉴定;DNA完整性鉴定：; ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????;5、核酸的贮存——DNA保存 ;核酸的贮存——RNA保存：;三、基因组DNA的分离与纯化;（一）、DNA样品准备;DNA提取前样本采集、预处理和保存：;（二）、DNA提取;酚 抽 提 法 提 取 步 骤：;DNA酚抽提法示意图;主要试剂的作用： EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性;SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性;蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用;苯酚： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降???DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA;DNA的沉淀：;（二） 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。;（三）磁珠法： 磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸分离，再通过移动磁珠来获取DNA ;（四）微柱法 ： 利用DNA在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中;（三）、DNA的浓缩;（四）、DNA回收 ;DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因组DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护DNA长度;四、RNA的分离与纯化;（一）、样本来源;每个细胞的RNA量约为10-5 μg 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA…;组织材料;（二）、 RNA提取的独特性—关于RNase酶;RNase酶;去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键 必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性;2. 外源性RNA酶(extrinsic RNase) 主要来源： 被污染的缓冲液 细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶 自动移液装置;3. 实验室采取避免RNA酶污染的措施 设置专门RNA移液装置 小份保存缓冲液 设置专门的RNA电泳装置 准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿、 DEPC处理水等 分离RNA过程中使用RNA酶抑制剂;4. RNA酶的去除;5. RNA提取所用器皿的处理;6. RNA提取所用