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重组DNA技术 重组DNA技术 1 获得需要的目的基因 （外源基因） 2 构建重组质粒和基因 克隆 3 转化受体细胞和转化 子的筛选 4 转化子的分析—— Southern杂交 生命通过繁殖而 延续，DNA是生 物遗传的基本 物质 漂亮的模特儿 遗传学家 漂亮的模特儿 遗传学家 生物技术 重组DNA技术是基因工程的核心技术 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴 起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基 因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生 物学操作步骤。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地 把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体 中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产 物。 1 获得需要的目的基因（外源基因） 获得需要的目的基因常用的方法： （1 ）直接从生物体中提取总DNA ，构建基因文库 (gene library)，从中调用目的基因； （2 ）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA 片 段； （3 ）利用聚合酶链式反应（PCR ）特异性地扩增所 需要的目的基因片段，等等。 细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建 细胞内总DNA的提取分离程序 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。 基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬 菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。 反转录人工合成互补DNA 构建基因文库获取目的基因 费时费事 内含子序列 以mRNA为模板，以短的寡核 以mRNA为模板，以短的寡核 苷酸（oligo(dT)）分子作引物， 苷酸（oligo(dT)）分子作引物， 加入 dATP, dTTP, dGTP 和 dCTP, 加入 dATP, dTTP, dGTP 和 dCTP, oligo(dT) 与mRNA 分子 的 多 聚 A oligo(dT) 与mRNA 分子 的 多 聚 A （polyA）尾巴碱基配对，在逆转 （polyA）尾巴碱基配对，在逆转 录酶的作用下，根据碱基互补原 录酶的作用下，根据碱基互补原 则人工合成一段与之互补的DNA片 则人工合成一段与之互补的DNA片 段，这一过程称 为反转录 。接 段，这一过程称 为反转录 。接 着，在大肠杆 菌DNA聚合酶 I的 着，在大肠杆 菌DNA聚合酶 I的 Klenow片段的作用下，再以第一 Klenow片段的作用下，再以第一 条DNA为模板，人工合成另一条互 条DNA为模板，人工合成另一条互 补的DNA子链。这种经过mRNA反转 补的DNA子链。这种经过mRNA反转 录人工合成的双链DNA被称为互补 录人工合成的双链DNA被称为互补 DNA （cDNA）。在细胞分化的不同 DNA （cDNA）。在细胞分化的不同 阶段，根据代谢反应 的特殊 需 阶段，根据代谢反应 的特