基因工程_第一章_基因操作的基本技术.pptVIP

第一章 基因操作的基本技术 第一节 核酸制备 一、细胞总RNA的制备 1、一般原则及对策（抑制RNase） *高温长时处理：180?C 2hrs *二乙基焦碳酸乙酯（DEPC） *使用对RNase有强烈抑制作用的细胞裂解剂 如盐酸胍、异硫氰酸胍（裂解、抑制、解聚） 氧钒基核苷复合物-RNA类似物 RNasin-胎盘中制得 *防护与隔离：戴手套、口罩 *控制温度：季节因素 2、方法（热酚、氯化锂、盐酸胍、异硫氰酸胍法、试剂盒） （1）胍-氯化铯法 组织块放入液氮打磨破碎? 加入异硫氰酸胍? CsCl2密度梯度离心 得到RNA纯度高，完整性好，设备昂贵 （2）胍-热酚法 组织块放入液氮打磨破碎? 加入异硫氰酸胍? 60?C用注射器抽吸，剪切DNA ?热酚抽提 3、总RNA制品的质量控制 （1）RNA的浓度和纯度测定 A260nm 1 OD=40 ?g/ml RNA 要求A260nm/A280nm=2.0 (1.7-2.0或2.0) A260nm/A230nm 2.0 （2）RNA的完整性 变性琼脂糖凝胶电泳检查 28S：18S?2：1 （3）总RNA制品的保存 溶液法（TE或0.5%SDS 方便 但不稳定) 悬液法（溶液加3V乙醇 可靠 但不方便） 二、染色体DNA的分离 1、主要原则：祛除蛋白及细胞碎片、祛除RNA、保持 DNA 分子完整 2、主要试剂及作用：SDS（破坏膜结构 变性 解聚） EDTA（抑制酶活）、Proteinase K 3、制品的鉴定 A260nm 1 OD=50 ?g/ml DNA 要求A260nm/A280nm 1.7 A260nm/A230nm 2.0 三、?噬菌体DNA的制备 1、噬菌体滴度的测定：逐级稀释-涂布-噬斑形成 2、感染：phage:E.coli=1:10 生活史（裂解 溶源化）Genetic-Main Menu-Bacterial and phage-Phage genetic-Phage life 3、 ?噬菌体DNA的提取 转染-裂解-收集-DNase RNase消化-PEG沉淀病毒-除蛋白外壳-DNA 四、某一特定分子量 DNA片段的制备 1、低熔点琼脂糖（low melt point） 羟乙基 60?C-65 ?C 熔化 较纯 2、透析袋法 （需浓缩） 3、苯酚抽提法 4、反复冻融法 5、电洗脱法 6、硝酸纤维素膜离心法 7、试剂盒 _ + 复习提纲 1、掌握提取细胞总 RNA的原则。如何实施？为什么？ 2、掌握如何进行RNA 制品的质量控制. 3、掌握染色体DNA制备 的原则。各有哪些主要试剂？其作用各是什么？ 4、掌握如何进行DNA样品的鉴定。 5、掌握DNA片段制备的方法。 第二节 质粒及质粒载体 一类亚细胞有机体 F质粒 （Fertility F因子或性质粒 可转移） R质粒 （Resistance 抗药性因子） Col质粒 （产生大肠杆菌素因子） 一、质粒（ plasmid）的一般生物学特性 1、质粒 存在于细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分，由环状双链的DNA组成的复制子（例外 Killer plasmid-酵母） 赋予宿主特殊特性：抗药性 糖酵解 抗重金属 隐蔽质粒（cryptic plasmid) 2、质粒的转移 分类：接合型 （F Col R 可自我转移） 非接合型（Col R） 3、质粒 的迁移作用 由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移 控制因素： mob(编码核酸酶) bom(nic 核酸酶作用位点) 4、质粒的复制类型 拷贝数的定义： 生长在标准培养条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目 每个细菌细胞染色体平均具有的质粒DNA分子的数目 严密型（stringent） 1-3 松弛型（relaxed） 10-60 5、质粒的不相容性（incompatibility) 在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定存在 E. coli （30） 金黄色葡萄球菌（13） 二、质粒载体 1、用做克隆载体的质粒必须具备的基本条件 *多个单一的酶切位点（Multiply Cloning Sites） *具有复制起点（origin ori）,可导入宿主 *具有选择标记（Apr Cmr Smr） *低分子量 2、质粒载体类型 (1)高拷贝质粒载体（ColE1 pMB1） (2)低拷贝质粒载体（pLG