[医学]14 重组DNA技术.pptVIP

重组DNA技术 Recombinant DNA Technology 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功； 1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了DNA序列的快速测定法； 1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中合成人胰岛素； 1982年Palmiter等培育“巨鼠”(转入生长激素基因)； 1985年Cetus公司Mullis等发明PCR扩增技术； 1991年首例基因治疗初获成功（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）. 主要介绍： 基因克隆 DNA序列测定 核酸分子杂交 PCR DNA芯片 转基因生物 基因诊断与基因治疗 第 一 节重组DNA技术概述  Overview of Recombinant DNA Technology  二、重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作 重组DNA技术(recombinant DNA technology), 即在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件(又称载体)中, 形成重组的DNA分子, 并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。又称分子克隆、基因克隆、基因工程或遗传工程。 一、工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途 限制性内切核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）构建重组DNA分子还需要其他工具酶 碱性磷酸酶能去除DNA分子的5?-磷酸基 DNA聚合酶和核酸外切酶用于修剪限制性片段的末端 脱氧核苷末端转移酶用于DNA分子加尾以构成粘性末端 能自主复制； 有至少一个选择性标志； 有适宜的单一限制酶切位点（多克隆位点)； 应有高的拷贝数。 三、宿主细胞为重组的DNA分子提供扩增 、筛选和表达的场所 第 三 节DNA 克 隆 DNA Cloning 目的基因的获取: 1．化学合成： 2．从基因组文库中筛选： 3．从cDNA文库中筛选： 4． PCR扩增 载体和目的基因的重组DNA克隆的核心过程是构建重组DNA分子 DNA连接酶将载体 DNA与外源DNA连接 (1) 粘端连接 (2) 平端连接 (3) 同聚物加尾连接 (4) 人工接头(linker)连接 重组DNA导入受体细胞； 将重组DNA导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法 ① 将外源DNA转入细菌的过程称转化(transformation) ② 将外源 DNA直接转入动物细胞的过程称转染 (transfection) ③ 采用包装病毒将外源DNA转入细胞的过程称感染 (infection) 重组DNA的筛选和鉴定重组分子可通过扩增、筛选与分离鉴定而获得标志筛选和序列分析可用于重组子的筛选和鉴定 （1）质粒的抗性基因是转化菌的筛选标志 （2）用插入失活筛选重组子 （3）标志补救(marker rescue)是筛选转化酵母的常用方法 （4）限制性图谱和核酸序列分析可直接鉴定外源 DNA 克隆DNA的相关分析Analysis of Cloned DNA 核酸的变性、复性与分子杂交（P435） 5 ‘ GATCGATCGATCGATC 3’ | | | | | | | | | | | | | | | 3’ CTAGCTAGCTAGCTAG 5’ + heat 5 ‘ GATCGATCGATCGATC 3’ Add 3’ TAGCTA 5’ Labeled (Radioactive) Cool 5 ‘ GATCGATCGATCGATC 3’ | | | | | | | | | | | | 3’ TAGCTA TAGCTA 5’ Southern blot 成人型多囊肾病 常染色体显性遗传病，30-50岁发病，单侧或双侧肾组织囊肿，挤压肾组织导致肾衰竭或尿毒症致死。 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 宿主细胞（host cells）是重组分子进行繁殖的场所。理想的宿主细胞通常是DNA或蛋白质降解系统缺陷株或重组酶缺陷株，因而具有较强地接纳外源DNA