实验八—荧光分析.ppt

实验八—荧光分析法测荧光素钠和激光拉曼光谱仪的演示 实验目的 1. 掌握标准曲线法测定荧光物质的原理和方法。 2. 进一步熟悉970CRT和F380荧光光度计的使用。 3.了解RBD-IV型激光拉曼光谱仪结构和操作 4.了解分子振动拉曼光谱的基本原理，测定CCl4分子振动拉曼光谱 实验原理（荧光） 碱性条件下，荧光素钠有强荧光，可以进行定性及定量分析，在低浓度范围内，发射的荧光强度与其浓度或含量成正比。 荧光素钠的结构式 C20H10Na2O5 实验步骤（荧光） 定性分析 参数：EX = 495 nm，EM = 515 nm，EX范围430～540 nm，EM范围480～570 nm。灵敏度、扫描速度、缝宽：2、高、10、10。 取0.8 mL 荧光素钠标准溶液于试管，加入1.0 mL NaOH，用去离子水冲稀至10 mL，摇匀。扫描激发与发射光谱，确定最大激发与发射波长。 实验步骤（荧光） 定量分析 取6支试管，按下表加入试剂 实验步骤（荧光） 酸度的影响 取3支试管，各加入0.8 mL 荧光素钠标准溶液，取其中两支分别加入1 mL NaOH、1 mL HAc，用去离子水冲稀至10 mL，摇匀，测INT，比较其大小。 实验原理（激光） 拉曼散射 思考题 荧光定量分析的原理是什么？ 荧光素钠的荧光强度与酸度有何关系？ 解释下列概念： (1)拉曼散射 (2)瑞利线? (3)斯托克斯线 (4)反斯托克斯线 (5)拉曼频移 怎样利用玻尔兹曼分布律来解释斯托克斯线与反斯托克斯线强度的不同? * INT X 80 60 40 20 0 对应含量×200 ?g 1 0 0.4 3 1 0 0.2 2 1 0 0 1 1 1 1 1 mol/L NaOH mL 0.3 0 0 被测溶液 mL 0 0.8 0.6 0.5μg/mL荧光素钠mL 6 5 4 拉曼散射就是利用散射光频率分布在用于激发的入射光频率两侧不远的现象，并选择适当的(可见的)激发光，把红外光谱移到可见光区来研究分子结构的光谱方法。 当入射的光量子与分子进行弹性碰撞时，光量子与分子均没有能量交换，则入射光与散射光频率相等，叫瑞利散射； 当光量子与分子进行非弹性碰撞时，光量子会与分子发生能量交换，分子因此发生能级跃迁，为拉曼散射。散射光频率低于瑞利光的谱线叫斯托克斯(stockes)线，而频率高于瑞利光的谱线叫反斯托克斯(anti-stockes)线。 拉曼散射效应是印度物理学家拉曼（C. V. Raman）1928年首次发现的，因此荣获1930年的诺贝尔物理学奖。 1928~1940年，受到广泛的重视，曾是研究分子结构的主要手段。这是因为可见光分光技术和照相感光技术已经发展起来的缘故； 1940~1960年，拉曼光谱的地位一落千丈。主要是因为拉曼效应太弱（约为入射光强的10-6），并要求被测样品的体积必须足够大、无色、无尘埃、无荧光等等。所以到40年代中期，红外技术的进步和商品化更使拉曼光谱的应用一度衰落； 1960年以后，激光技术的发展使拉曼技术得以快速发展。激光束的高亮度、方向性和偏振性等优点，成为拉曼光谱的理想光源。 样 品 池 透过光λ不变 瑞利散射λ不变 拉曼散射λ变 λ增大 λ减小 Stocks(斯托克斯)线： 能量减少，波长(数)变长(小) Anti－Stocks线： 能量增加，波长(数)变短(大) CCl4的拉曼光谱 Stocks lines anti-Stockes lines Rayleigh scattering Δν/cm-1 拉曼频移（Raman shift） Δν=| ν 0 – ν s |, 即散射光频率与激发光频之差。 Δv取决于分子振动能级的改变，所以他是特征的。 适用于分子结构分析 与入射光波长无关 单色仪 光电倍增管 高压电源 光子计数器 驱动电路 计算机 显示器 样品 激光器 凹面镜 激发光源通常采用连续波激光器，常用的有氩离子激光器(514.5 nm)、氦—氖激光器(632.8 nm)、半导体激光器(532.0 nm)等。 仪器使用的注意事项 1.保证无强震动源、无强电磁干扰；不可受阳光直射。 2.光学器件表面，不允许接触、擦拭， 3.实验结束，先取出样品，再关闭开关。 4. 激光器电源开、关机的顺序正好相反。