[工学]第7章 蛋白质的分离纯化和表征.pptVIP

第六节　蛋白质的重要性质 蛋白质两性解离性质和等电点 蛋白质胶体性质 蛋白质的沉淀 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 蛋白质变性与复性 核糖核酸酶变性与复性作用 蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 注意事项 透 析（dialysis） 超过滤（ultrafiltration） 离心机结构示意图 沉降系数（sedimentation coefficient） 密度梯度离心法（density gradient） 分子筛层析（gel-filtration chromatography） 分子筛层析原理示意图 分子筛层析与洗脱曲线 洗脱体积与相对分子质量的关系 电泳的一般原理 电泳技术分类 常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE） 不连续PAGE的浓缩效应 SDS 等电点聚焦（isoelectric focusing） 琼脂糖电泳 不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围 毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE) 毛细管电泳装置示意图 蛋白质、核酸的定性定量检测 垂直板电泳 毛细管电泳 水平板电泳 电泳支持物 滤纸 凝胶 薄膜 圆盘电泳 1、醋酸纤维薄膜电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、琼脂糖电泳 4、毛细管电泳 1、一般PAGE 2、SDS、PAGE等电点聚焦 ?PAGE是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物，采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性) 或 连续体系（一层凝胶、一种pH和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。 ?PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N?-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。 化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED 光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED ?不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应 样品 浓缩胶 分离胶 快离子 慢离子 蛋白质 A B C + + - - 样品 浓缩胶 分离胶 电极缓冲液 低电位梯度E11 高电位梯度E21 + - 原理： 当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示： Log Mr=a – bmr 应用: 测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数 Mr（相对迁移率） mr（相对迁移率） Log Mr 原理: 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。 应用： 高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量 pH10 pH3 pI1= pH8 pI2= pH7 pI3= pH5 - + 线性梯度 ?琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，这种多糖链在1000C左右时呈液态，当温度下降到450C以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 ?琼脂糖凝胶用作电泳的固相支持物具有分子筛效应，其对生物分子的分离作用不仅与其分子的构象及其相对分子质量大小有关，而且与凝胶的浓度也有密切关系，故可根据分离对象分子量大小选择适当浓度的凝胶。 ?琼脂糖电泳常用于核酸分离，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为2OObP至5Ok