突变基因的RFLP连 锁分析2015.pptxVIP

突变基因的RFLP连锁分析 实验原 理通过在具有多态性位点的DNA 序列的两端设计引物，扩增出DNA 片段经限制性酶切，利用有酶切位点的和无酶切点的序列经扩增酶切后所得片段长度不同，通过电泳可以很方便地加以识别，这种方法称PCR-限制性片断长度多态（restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）实验流程PCR扩增DNA片段酶切电泳结合分析一、PCR（１） DNA 样品：浓度以0.3～0.6 mg/ml 为宜。（２） 引物： 上游引物：5’ TGACCTCCAGGATCAGTC 3’ 下游引物：5’ AACAGGCAGAGCAGTGAA 3’PCR 试剂：无菌水、10X PCR buffer、dNTP、rTaq 酶２. PCR 反应条件95℃ 5min94℃ 30s60℃ 20s 30 cycle72℃ 60s72℃ 10min4℃ 1h１. PCR 反应体系（20 ｕl 体系）无菌水 14μL模板DNA 1μLdNTP 1.5μL上游引物 0.5μL下游引物 0.5μL10X buffer 2μLrTaq 酶 0.5μL二、限制性内切酶酶切技术限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链DNA分子中的特异序列（一般识别4－6个核苷酸序列）由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，