[理学]基因克隆与表达-final-ZJJ.pptVIP

;基因克隆(gene cloning) RACE技术服务 基因表达(gene expression) -原核基因表达 -真核基因表达 ;基 因 克 隆 Gene Cloning;概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程;一、概述;1973年Cohen完成第一个基因工程实验;----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。;基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 ;基因克隆的技术路线 目的基因 载体 ;;二、克隆载体;三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性;四、体外重组的策略;4、T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A ;五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 （二）体外重组 （三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR （五）测序 ;样品的要求;服务流程;完成时间;最终产品; ;技术背景 RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节 存在的问题及解决办法 最终产品的要求 ;技 术 背 景;RACE的优点;RACE的基本概念;基本原理和方法;3’RACE原理示意图;RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得;;不同厂家RACE试剂盒的介绍;RACE技术的关键环节;存在的问题及解决办法;RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验： 引物不能设计在保守区简并引物区。 各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。 尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正确性。;PCR扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题 一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物； 另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法： 热启动PCR(hotstartPCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touch－down PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。 单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照，并减少引物的浓度。;A;图 5’RACE、3’RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果 Fig. The contig result of 5’RACE 、3’RACE and GsAP2 by software ;完成时间;最终产品;RACE技术应用;基因的表达 Gene Expression ;一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 ;;据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。;二．原核生物基因结构和表达特点 ;原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 ;3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 ;五．原核表达载体：? 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因 ;技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体;优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性;Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T