液相色谱分离方法.ppt

Hewlett-Packard 液相色谱分离方法 一、前言 在液相色谱中通常都强调流动相的作用，如流动相的极性，流动相的选择性和流动相的优化等等，这是因为在液相色谱中流动相参与柱色谱过程的分配作用，而且组分的最佳分离在很大程度上取决于流动相的选择和优化，并因此而忽略了柱子在液相色谱分离过程中的作用。然而世界上成千上万种化合物是否能被一类固定相分离呢？也就是说，只要选择合适的流动相而不必选择固定相呢？事实恰恰相反，固定相在不同类化合物的分离中起着相当重要的作用，它决定了物质的分离过程，也决定了流动相的基本性质。 其实液相色谱的主要分类方法就是根据固定相或溶质与固定相之间的分配形式而分类的。如吸附色谱以吸附剂为固定相；分配色谱以键合相为固定相；离子色谱以离子交换剂为固定相；排阻色谱以多孔惰性小球为固定相；旋光异构体色谱以手性固定相为固定相；亲和色谱使用配体固定相等等。 二、分离方法 1. 吸附色谱 吸附色谱，文献中也称之为液固色谱或正相色谱。吸附色谱是最经典的色谱分离过程，固定 相是吸附剂，流动相是以非极性烃类为主的溶剂。 分离原理 溶质的分离取决于溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争。由于不同溶质的吸附强度不同而彼此分离。 以硅胶为例，硅胶表面含有羟基（Si－OH），在其周围的化合物可能与硅胶发生偶极和诱导偶极，偶极与偶极，氢键，电荷转移和形成π－络合物等各种作用。这些作用不仅取决于分子所具有的官能团和不饱和键，而且还依赖于分子的大小和构型。对于在吸附色谱过程中溶质的保留机理，提出较早而且简单容易理解的是顶替模型： ? 在色谱中吸附剂表面所有的活性点不同程度地被溶剂分子所占据，如果溶质与吸附点的作用力超过溶剂分子，溶质分子才被吸附。 ? 溶质分子中的官能团或双键最靠近吸附点。 ? 相互作用力不仅取决于溶质分子的官能团，而且还依赖于它们的空间结构，如异构体。 ? 如果溶质分子的体积大于溶剂分子，则一个溶质分子可能要顶替几个溶剂分子，占据较大的吸附面积。 实际上，除了顶替作用，极性溶剂和溶质分子不仅与硅胶表面的硅羟基相互作用，而且还与固定相表面上的其它活性点发生程度不同的相互作用，这种作用称为定位效应。另外，顶替模型也没有考虑溶剂与溶质之间的相互作用，这种作用在某些情况下，如形成氢键，是不能忽略的。 固定相 吸附色谱中最常用的固定相是硅胶，其次是氧化铝，为了某些样品的分离，也使用苯乙烯－二乙烯苯等聚合物作为吸附剂。硅胶表面的Si-OH是最主要的吸附点，氧化铝中Al3+是显著的吸附中心。选择吸附剂的原则是样品的性质和吸附剂本身所具有的品质。这些品质包括颗粒形状、颗粒粒径、表面积、孔径以及吸附剂表面的酸、碱性等等。 硅胶吸附剂有两大类：表面多孔型（Porous Layer Bead)和全多孔型(Totally Porous)。 全多孔型 表面多孔型 全多孔微粒硅胶按形状又分为球形、非球形，后者又称为无定形。非球形硅胶加工工艺简单，价格比较便宜。球形硅胶机械强度好，颗粒度均一，是比较好的高效液相色谱填充物。颗粒度一般为5～10um，3um的也有商品供应。一般选5um比较合适。 表面多孔型硅胶是一种薄壳型微珠，中心是一个没有孔的坚硬内核（玻璃，硅胶或惰性聚合物等）和一个薄的多孔型外壳所组成。外壳的厚度为固体核直径的1/10～1/30，它可以是硅胶，氧化铝或离子交换树脂等。表面多孔型硅胶填料颗粒度较大，短孔，但表面积小，容量低。 吸附剂的孔径和表面积对溶质保留和分离有影响，选择孔径主要根据溶质分子的大小，小分子选用7～12nm孔径的，大分子选用30nm的，一般来说孔的直径要比被分析的样品分子的直径大3倍。 最后是吸附剂表面的酸碱性。硅胶表面的pH值大约为5，碱性氧化铝的pH值为12。由于硅胶表面的pH值对大多数样品没有催化和强保留现象，因此常常使用硅胶柱。对于碱性化合物，例如吡啶和胺类，选择硅胶可能不合适，但这类样品可选用键合固定相实现分离与分析，因此氧化铝已很少使用。 流动相 在吸附色谱中，固定相是吸附剂，因此流动相多以非极性溶剂为主。可作为流动相的溶剂很多，这些溶剂大致可分为三类： ? 一类是非极性溶剂，如正己烷等烃类。 ? 一类是中等极性的，主要是卤代烃、酯类； ? 一类是极性的，如醇和乙腈等。 水虽然是极性很强的溶剂，但水分子会永久地吸附在吸附剂的表面上而导致活性降低而失去分离作用。一旦柱子因水的吸附而失效则需要再生。 溶剂选择有两个原则： ? 一是溶剂强度。溶剂强度决定了溶质的K’，即保留时间，为了改善组分的分离，可延长分析 时间。 ? 二是溶剂的选择性。溶质对的分离最终取决于溶剂的选择性。在影响色谱中使用单一溶剂的情况是很少的，多数情况下都采用混合溶剂。混合溶剂指流动相是由