第03章_核酸的结构与功能.pptVIP

第3章核酸的结构和功能 Structure and Function of Nucleic Acid 体内重要的游离核苷酸及其衍生物 3.含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP 三、DNA的功能 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线。 第5节 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 一、核酸分离与纯化的一般原则 操作中要注意： 1.采用温和的条件 2.防止过酸、过碱、 3.避免剧烈搅拌等 4.抑制核酸酶的活性 5.防止核酸分子被降解和变性 二、核酸的分离与纯化 酚抽提法 凝胶电泳法 四、核酸序列分析（DNA自动测序） 双脱氧链终止法 DNA指纹 第 6 节 核 酸 酶 Nuclease 紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(melting temperature, Tm)。 影响Tm值的因素： 1．DNA的均一性 2．G-C碱基对含量 3．介质中的离子强度 三、DNA的复性与分子杂交 DNA复性(renaturation) 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 在DNA复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链。 这种现象称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交(hybridization) DNA-DNA 杂交双链分子 不同来源的DNA分子 原则：防止核酸的降解和变性，要尽量保持其在生物体内的天然状态。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比分子形式易溶于水。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 核酸的溶解性质 酚抽提法 分离目的：天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 操作步骤： 1.取全血（或加抗凝剂后的血浆与红细胞之间的白细 胞层）200μl,加双蒸水200μl，振荡20s； 2.加6 mol/L碘化钠溶液200μl，振荡20s； 3.加氯仿/异戊醇（49:1）400μl，振荡20s，12000 r/min 离心 12 min； 4.取上清液，加0.6倍体积异丙醇，振荡20s； 5.放置15~30min，12 000r/min 离心 12 min，弃上 清液； 6.加37% 异丙醇溶液 1 ml，不振荡，12 000 r/min 离心12 min，弃上清液，37℃挥干； 7.加TE（pH 8.0）50μl溶解残余物，置4℃保存待用。 双脱氧链终止法 原理：DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。 操作详见：animation3、4 DNA指纹 把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同个体。 现代分子生物学知识告诉我们，人身上的每个细胞有总数约为30亿个碱基对的DNA，而每个人的DNA都不完全相同，人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多（克隆人除外），因此通过分子生物学方法所显示出来的人的DNA模样就会因人而异，人们就可以像指纹那样分辨人与人的不同了，这也就是“DNA指纹”一词的由来。 DNA指纹除了具有指纹所能行使的功能以外，它还有其更具革命性的特点，这个特点是与DNA的本质分不开的，即DNA的遗传性。由于DNA是负责遗传特性的基本物质，因此通过对DNA指纹的鉴定就可以判断两个人之间的亲缘关系，而不仅仅是分辨人与人的不同了。 在DNA指纹图上孩子的DNA谱带必定有一半与母亲相同，另一半与父亲相同。也就是说生父应该具备孩子DNA指纹图中所有的非母谱带。 （三）真核生物DNA在核内的组装 真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。 核小体的组成 DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4 H2A、H2B、H3和H4各两分子组成组蛋白八聚 体，构成核心组蛋白 双螺旋DNA以