细胞免疫学技术PPT.ppt

第十章 免疫细胞学技术;第一节 免疫细胞分离技术;二、外周血单个核细胞的分离;形成密度梯度的介质;1、Ficoll 分离法;;2、Percoll分离法;原理： 主要材料： 分离过程： 结果：;三、 淋巴细胞分离技术;尼龙毛分离法;注意事项： 1、尼龙毛与尼龙毛柱 2、洗柱速度 3、温度与pH值;（二）淋巴细胞亚群的分离;; 1、免疫溶解法;注意事项： 1、预实验 2、对照组 3、处理细胞的密度 4、补体的来源 5、缺点：;;注意事项;玫瑰花环分离法;;五、流式细胞分选术;免疫磁珠分离技术;;瑞士Dynal公司： 磁珠 基因公司： 磁式细胞分选器 （magnetic activated cell sorter MACS);CD34+造血干细胞分离试剂盒;Mini MACS MACS正选柱 其他： 淋巴细胞分离液 Hanks液 ;细胞分离过程：;注意事项：  标记要快速、低温 小心淋洗细胞 缓冲液要除气 柱子使用前用4%BSA预处理 ;优点: 1.细胞种类广 2.分离纯度高 3.分选方式灵活 4.细胞活力好 5.细胞处理量大 缺点: 费用大;四、 吞噬细胞的分离和收集;第二节 淋巴细胞标志和功能检测;一、 概述;T细胞表面标志;B细胞的表面标志;NK细胞;二.淋巴细胞表面标志的检测;T细胞表面主要CD抗原及其特异性;特异性抗原的检测;间接免疫荧光法 ;普通显微镜观察 间接法: 未标记抗体酶法(以酶作为抗原,制备抗体): APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶）桥联免疫酶染色法 ;APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶） 桥联免疫酶染色法; ABC(avidin-biotin- peroxidase complex )法;ABC(avidin-biotin-peroxidase complex)法;T细胞特异性受体的检测; 原理：T-SRBCR+SRBC E花环 （erythrocyte） 特点：Et代表总T细胞，占60-80%，4℃2小时； Ea代表T细胞一亚群，占20-40%，短时间温育 (1)检测T细胞（2）用SRBC（3）E花环结合不牢固 ;B细胞表面标志的检测;Ｂ细胞表面抗原的检测;Ｂ细胞受体的检测;SmIg的检测;Ｆc受体和补体受体的检测;原理 E+A（antibody） EA复合物 +B-FCR EA花环 ;? E+A EA复合物+C EAC +B-CR EAC花环 ;T细胞功能的检测;T淋巴细胞增殖试验;淋巴细胞转化的刺激物; 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR掺入 收集细胞 ? 检测β射线 ;T细胞介导的细胞毒试验lymphocyte mediated cytotoxicity LMC;方法 ;B细胞功能的检测;B细胞增殖能力的试验; ;染色计数; 趋化 吞噬 胞内杀灭作用 ;中性粒细胞功能的检测 ;细胞运动功能的检测;白细胞吞噬功能的检测;白细胞杀菌功能检测的检测; 白细胞＋菌液;中性粒细胞杀菌 耗能 代谢 生成H+ ;化学发光法: 敏感;巨噬细胞功能的检测; 受检细胞+颗粒性抗原(鸡红细胞等) 涂片、染色、镜检 吞噬率 吞噬指数 ;酸性磷酸酶的测定 ;酸性磷酸酶的测定;非特异性酯酶的测定 ;Fc受体 EA花环 C3b受体 EAC花环试验 ;第四节 细胞