[农学]微生物基因工程.pptVIP

第六讲 微生物基因工程及其应用 第一节 微生物基因工程原理 二、大肠杆菌基因工程菌的构建策略 三、基因工程菌遗传不稳定性及其对策 （一）工程菌遗传不稳定性的表现与机制 四、细菌表达异源蛋白的流程 第二节 微生物基因工程的应用 一、药物生产 （二）重组人生长激素 （三）重组人干扰素生产 （四）重组人抗体及其片段的生产 二、疫苗生产 1、基因缺失活疫苗 2、基因工程亚单位疫苗 3、核酸疫苗 4、蛋白工程疫苗 三、重组微生物工程菌与食品、饲料工业 （一）重组工程菌与干酪生产 （二）重组工程菌与单细胞蛋白质生产 （三）重组工程菌与酿酒工业 （四）重组工程菌与氨基酸生产 （五）重组工程菌与维生素生产 四、重组微生物工程菌与环境保护 五、重组微生物工程菌与农业生产 * * 原核细胞表达真核基因存在的困难： ① 原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子 ② 由于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除后才能成为成熟的mRNA，但原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 ③ 在原核细胞中，mRNA必须含有SD序列才能和核糖核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转录的mRNA缺少SD序列。 ④ 真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定，容易被细胞蛋白酶所破坏。 一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特点 例：大肠杆菌基因工程 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 由高效表达构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下以包涵体的形式存在于细菌细胞内。 包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 能简化外源基因表达产物的分离操作 优点： 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁 缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目的蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目的蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30% 以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在 分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 以分泌形式表达目的蛋白的优点 目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是在细胞质中的10倍 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去 以分泌形式表达目的蛋白的缺点 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍 蛋白质的分泌机制 分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大