[生物学]3细胞破碎分离.pptVIP

* 1) 生物法（酶溶法 Enymatic lysis) 生物法是利用溶解细胞壁的酶处理细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。 A.外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶、 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶 * 特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。 革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。 * 有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时 （1）先加入蛋白酶溶解蛋白质-甘露聚糖结构， （2）再加入葡聚糖酶溶解葡聚糖层， （3）最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。 * B.自溶作用 自溶作用是酶溶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 * 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素等，可以改变细胞壁或膜的渗透性，从而使胞内物质有选择地渗透出来。 2) 化学渗透法（Chemical permeation） * 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质，使某些组分从细胞内渗漏出来。 优点：成本低，反应激烈、速度快 缺点：不具选择性。 A. 酸、碱处理法 * 细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）； 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 B. 表面活性剂 表面活性剂是都是两性的，既能和水作用也能和脂作用； 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏磷脂层，使某些胞内物质释放出来。 能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解。 * 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 C. 有机溶剂 * 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度 化学渗透法特点： 缺点 对产物释放有一定的选择性 可使一些较小分子量的物质（多肽和小分子的酶蛋白）透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 优点 * 3) 物理法 渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法 * A.渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法 将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），使细胞脱水收缩；再放入水或缓冲液中，使细胞快速膨胀破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。 * B.冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 作用机理：一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 * 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质 C. 干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 * * 选择破碎方法的依据： 细胞处理量； 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)； 目标产物对破碎条件的敏感性； 破碎程度； 目标产物的选择性释放 * 破碎率的测定 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。 直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法 采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红