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第十一章 抗体制备 抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本章主要介绍三种类型抗体的制备方法。 一、免疫原制备 免疫原(immunogen）是指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。 （一）细胞性抗原的制备 1.绵羊红细胞的制备 2. 细菌抗原的制备 （二）可溶性抗原的制备　 1. 细胞破碎 （1）物理法：物理破碎法主要有高速组织捣碎机处理法、玻璃匀浆器处理法、超声破碎法、反复冻融法等方法。 （2）化学法：化学法主要有酶处理法、表面活性剂处理法等方法。 2.可溶性抗原的提取与纯化 （1）超速离心分离法 （2）选择性沉淀法 ①盐析法： ②有机溶剂沉淀法：。 ③高分子聚合物沉淀法：。 ④等电点沉淀法：。 （3）超滤法： （4）层析法 ①凝胶过滤法 ②离子交换层析法 ③亲和层析法 （5）电泳法 3.纯化抗原的鉴定 抗原鉴定：含量、分子量、纯度及免疫学活性等。 蛋白含量的测定可采用双缩尿法、酚试剂法、紫外光吸收法等； 分子量鉴定可用SDS法、凝胶过滤法等； 蛋白质纯度鉴定方法常用的有：醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法等。 免疫学活性鉴定常用免疫双向扩散法、免疫电泳法或ELISA法等。 （三）半抗原性免疫原的制备 1.载体选择 常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。 （1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。 （2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。 2.连接方法 半抗原与载体的连接有物理法和化学法。 物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等； 化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。 根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。 （五）免疫佐剂 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。 佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂，如氢氧化铝、明钒等； ②生物性佐剂，如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； ③人工合成佐剂，如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； ④油剂，如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； ⑤纳米佐剂。 弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。 佐剂与抗原混合乳化的方法： 研磨法 和搅拌混合法两种 2. 佐剂的免疫生物学作用 ①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。 3. 佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种： ①可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强