PGM_实验_2012.pptVIP

吕慧能 2011.1. Cohen在重组DNA技术中杰出贡献III:与Boyer合作创建重组DNA分子 1972, Herbert Boyer 在Hawaii一科学会议上介绍他的 EcoRl Stanley Cohen在听众中，当时他质粒上的成果丰硕，但正面临pSC101质粒的切割问题； Boyer‘s EcoRI对Cohen来说看似是合适的；他邀请Boyer一起进行一系列的研究。他们坐在了一起讨论，欲将离体DNA重组技术带入一个新的时代； 他们计划先将二个质粒重组成一个质粒； 成功后将一外源DNA导入到质粒中； 吕慧能 2011.1. Boyer and Cohen 的策略 吕慧能 2011.1. ◆pSC102,体内构建的重组体 ●他们首先检查了EcoRⅠ对质粒pSC101和R6-5的切割情况，发现EcoRⅠ在质粒pSC101上只有一个切点，在质粒R6-5上有12个切点,这样就可以用pSC101作为重组DNA的载体分子。 吕慧能 2011.1. 他们用EcoRⅠ处理过的和没有处理过的 质粒pSC101和R6-5DNA分别转化E.coli C600,得到下表的实验结果∶ 表：环状和线状质粒DNA的转化 质粒DNA 每μg DNA转化子 四环素 卡那霉素 氯霉素 pSC101(未切割) 3×105 --- --- (EcoRⅠ切割) 2.8×104 --- --- R6-5(未切割) ---- 1.3×104 1.3×104 R6-5 (EcoRⅠ切割) ＜5 1×102 4×101 吕慧能 2011.1. ◆他们从用EcoRⅠ处理的R6-5的卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并检查了它的抗性，发现该克隆同时具有磺胺的抗性，但没有氯霉素、四环素的抗性。然后从该克隆中分离了一个环状质粒DNA，命名为pSC102，分子量大约为17×106。 吕慧能 2011.1. ◆接着用EcoRⅠ分别切割pSC102 和R6-5质粒DNA，进行电泳检查，发现pSC102被切成三个片段，相对于质粒R6-5的EcoRⅠ酶切片段Ⅲ、Ⅴ和Ⅷ。 ◆这些结果说明不同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在细胞内进行重组连接形成有功能的重组质粒。这一结果也提示，如果能够在体外重组成功，并能将重组体引入细胞内，同样具有生物学功能。 吕慧能 2011.1. ? pSC105，体外构建的重组体 ◆作者为了获得体外构建的重组体，分别用EcoRⅠ切割质粒pSC101 和pSC102,然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况，同时设计一些合理的对照实验。 吕慧能 2011.1. 质粒DNA 抗生素抗性的转化频率 四环素 卡那霉素 四环素＋卡那霉素 未用酶处理 2×105 1×105 2×102 EcoRⅠ处理 1.2×104 1.1×103 7×101 EcoRⅠ+ DNA连接酶 1.2×104 1.3×103 5.7×102 表：质粒pSC101 和pSC102混合DNA的 大肠杆菌C600的转化 吕慧能 2011.1. ?pSC101与RSF1010的共整合: pSC109的构建 ◆象pSC101一样，质粒RSF1010上也只有一个EcoRⅠ切点，所以只要用EcoRⅠ分别处理质粒RSF1010和pSC101，然后用DNA连接酶将两个线性DNA连接起来转化大肠杆菌，得到一个具有三种抗性的重组质粒∶四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。 ◆这种重组说明两个复制子能够重组，并能在细胞内表达。 吕慧能 2011.1. 基因(技术)史上的里程碑：基因工程的诞生 1973年美国斯坦福大学的Stanley N. Cohen (质粒载体研究和使用者)与加州大学Herbert W. Boyer (EcoRI 发现者)等人 Tetracycline pSC101 EcoR I DNA Ligase Kanamycin R6-5 Kanr and Tetr 吕慧能 2011.1. 三、重组：T4 DNA连接酶的连接方法 (1)粘性末端连接 (2)平末端连接 (3)同聚物接尾连接 (4) 接头连接法：Linker and Adaptor。 吕慧能 2011.1. 粘性末端转化成平末端或互补的粘性末端： 5’－突出： Klwnow酶填补， ＋4 dNTP成平末端 ＋某（几）种dNTP成互补的粘性末端 3’－突出： T4聚合酶：在高浓度4种dNTP下，切平； 在某（几）种dNTP下，切到有此核苷酸的位点。 S1核酸酶：切单链。 吕慧能 2011.1.