玉米籽粒发育关键基因的克隆与功能解析-洛阳会议演示幻灯片.pptVIP

河南农业大学 汤 继 华 2013年6月27日 玉米籽粒发育关键基因的克隆与功能解析 2013年11月洛阳 提高玉米单产的三个要素： 增加亩穗数——种植密度、株型（叶夹角）、抗倒性等 增加穗粒数——穗行数（穗粗）和行粒数（穗长） 提高粒重——增加籽粒体积（库）和光合产物积累（流） 豫82 2009年河南玉米的大面积倒伏 玉米的高密度栽培 一、玉米籽粒发育关键基因克隆研究意义 籽粒体积大小是光合产物积累的“库”，是决定玉米籽粒重量的关键因子。 粒长 粒宽 粒厚 一、玉米籽粒发育关键基因克隆研究意义 籽粒体积的三个构成因子 15d 35d 45d 玉米灌浆速率的动态曲线 胚乳细胞增长期，决定籽粒体积大小，即“库” 光合产物的有效积累期，即“流” 茎杆、叶片营养物质的再分配 一、玉米籽粒发育关键基因克隆研究意义 在自然群体获得了一个控制玉米籽粒厚度（大小）的突变体6244（百粒重22.3g），遗传分析结果表明该性状由一对隐性基因控制。 籽粒突变体F2 果穗上的籽粒分离 正常籽粒和小粒的比较 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 野生型 突变体 图2 突变体和野生型籽粒性状的比较 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 1、表型特征观察——籽粒厚度的增加，是导致体积增加的主要原因 140kb a：大粒的电镜示意图 b: 小粒的电镜示意图 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 1、表型特征观察——突变体表现为植株变矮，胚乳细胞大小无明显变化 2、组织细胞学分析——突变体的叶片、茎和跟部细胞与正常自交系相同 突变体 野生型 叶肉细胞 茎韧皮部细胞 根韧皮部细胞 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 4万株定位群体，将候选基因定位在120kb内，预测有3个候选基因。 A B 图3 候选基因的初步定位 图4 候选基因的精细定位 表2 目标区域内的候选基因 3、候选基因的精细定位与图位克隆——将控制玉米粒厚的主效基因定位在120kb内 甲基转移酶 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 候选基因在突变体与野生型的启动子区域有2个插入，编码区不存在差异。 该基因编码Cyclin-related protein，全长2578bp，包含5个外显子，编码337个氨基酸。 4、候选基因的序列分析——确定目标性状的候选基因 图5 ZmCRP 的基因结构 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 候选基因的启动子之间的差异 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 4、候选基因的序列分析——确定目标性状的候选基因 第二个外显子区域 第五个外显子区域 候选基因编码区的两个非同义突变点 GCA 丙氨酸 CCA 脯氨酸 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 4、候选基因的序列分析——确定目标性状的候选基因 候选基因100份自然群体中外显子区差异位点的测序分析 第二个外显子区域 第五个外显子区域 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型 100份自然群体中外显子区差异位点的测序分析 外显子差异位点一的部分测序结果 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型 AS2-1 AS1-1 Primer CACGACGTTGTAAAACGACCACCACAGAAGTCGAGATGG CACCACAGAAGTCGAGATGC CACGACGTTGTAAAACGACGGACAGAGACAGGTTTAACAATT GGACAGAGACAGGTTTAACAATC 基于AC—PCR的SNP标记 编码区差异位点在497份自然群体中的关联分析 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 6、候选基因的进化分析 在水稻和大刍草中启动子区域两个差异位点的分析 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 6、候选基因的进化分析 不同基因型水稻自交系的扩增结果 不同基因型大刍草扩增结果 在水稻和大刍草中对启动子区域两个差异位点进行分析 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 候选基因主要在分裂活跃的组织和器官中表达，而且野生型中的表达量明显高于突变体。 A B 图9 ZmCRP在突变体和野生型叶片和根中的表达 图 ZmCRP在突变体和野生型不同时期胚乳中的表达 7、候选基因的表达分析 二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析 ZmCRP过表达 CK 图 ZmCRP过表达载体的