传统的细胞因子克隆化策略.ppt

(1). 传统的细胞因子克隆化策略 活性筛选 发现免疫分子的活性线索? 免疫分子表达细胞? 提取mRNA ? 逆转录成为cDNA? 克隆化至真核表达载体? 转化大肠杆菌? 免疫分子活性筛选? 鉴定 酵母双杂交系统的建立与发展 酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。它有两个结构域： 1、 DNA结合结构域（DNA binding domain, DB ）由位于 N-末端1~147个氨基酸构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外， 在其N-端还具有一段核定位序列； 2、转录激活结构域（activation domain, AD）由位于C-末端的768~881位氨基酸构成。 当Gal4 的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性. Normal Transcription. Normal transcription requires both the DNA-binding domain (BD) and the activation domain (AD) of a transcriptional activator (TA). (DB) (AD) Reporter gene a reporter gene, which is simply a gene whose protein product can be easily detected and measured. X Y Ga14的DB Ga14的AD 诱饵(bait) 猎物(prey) 报道基因 表达 报道基因的基因产物 通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白之间是否可存在相互作用。 Plasmid construction. The bait and hunter fusion proteins are constructed in the same manner. The bait DNA is isolated and inserted into a plasmid adjacent to the GAL4 DB DNA. When this DNA is transcribed, the bait protein will now contain the GAL4 DNA-binding domain as well. The ‘prey fusion protein contains the GAL4 AD. ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? The yeast two-hybrid assay uses two plasmid constructs: the bait plasmid, which is the protein of interest fused to a GAL4 binding domain, and the hunter plasmid, which is the potential binding partner fused to a GAL4 activation domain. Ga14蛋白 调控的GAL1 序列 ?-半乳糖苷酶 的LacZ Field改造LacZ基因，将其整合到酵母菌染色体URA3位上 URA3 URA3 酵母菌的GaL4基因和GaL80基因（ Gal80是Gal4的负调控基因）被缺失 报道基因 表达融合蛋白的载体 URA3 转化酵母菌 URA3 表达?-半乳糖苷酶 已知 Ga14的DB 未知 Ga14的AD 融合蛋白 GENE DB X Y AD 猎物 诱饵 由X和Y相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将DB-X的融合蛋白称作诱饵（bait），X往往是已知蛋白；AD-Y称作猎物（prey），整个实验过程称作“狩猎”（hunt或fish）。 K Ga14的DB R Ga14的AD 融合蛋白 表达融合蛋白的载体 URA3 转化酵母菌 URA3 同时