[医药卫生]抗多肽制备流程及原理.ppt

化学合成多肽就把氨基酸按照一定的氨基酸排列顺序和连接方式连接起来。 为了得到具有特定氨基酸顺序的合成多肽，采用逐步缩合的定向合成方法，即先将不需要反应的氨基或羧基用适当的基团保护起来，再进行连接反应，以保证反应的定向进行。 3.4 羧基保护 目前使用的羧基保护大致可以分为三种 一种可以用碱皂化脱去，如甲酯、乙酯 另一种可以用酸脱去，如叔丁酯、对甲氧苄酯，邻苯二甲酰亚胺甲酯等 第三种除了用酸或碱脱去外，还可以用其他的方法选择性脱去，如苄酯、苯羰基甲酯、三甲硅乙酯 3.5侧链功能团的保护 由于不少氨基酸的侧链都带有能反应的基团，如羟基、巯基、酚基、B-和r-羧基、胍基、咪唑基、吲哚基和硫醚基等，为了避免副反应的发生，在多肽合成中往往也选用适当的保护基将它们保护起来 3.6 肽键生成的方法 形成肽键的方法基本可以分为四类：一是羧基活化法；二是氨基活化法；三是四组份合成法；四是利用蛋白水解酶的逆反应，亦称酶促合成法。 羧基活化法的基本原理是先将N-保护氨基酸或肽的a-羧基转变成活化型的RCOX，从而有利于NH2R’对它进行亲核反应生成RCONHR’。一般来说，取代基团X的吸电子性越强，其对羧基的活化能力也越强。 羧基取代基的活化能力顺序 3.7 肽键生成的方法 羧基活化法有碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯法、NCA法等 1.碳二亚胺法 2、混合酸酐法:反应一般分两部进行 活化酯的种类：1）芳基活化酯 2）烯基酯 3）与N-羟基化合物形成的活化酯 4）活化酰胺 5）固相活化酯 活化酯的制备：1）DCC法 2）转酯反应 3）加成 4）混合酸酐法 4、NCA法 NCA的合成：酰氯法、光气法 3.8 固相合成 固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合，最后达到所需要合成的肽链长度。 固相合成流程示意： 氨基酸在进入目的肽之前，氨基端需要保护基。根据保护基的不同，多肽固相合成方法可以分为两大类：Boc方法和Fmoc方法。 4. 抗多肽血清的制备 4.1 动物选择 要生成好的抗体，必须选择与抗原源差异较大的动物。要想获得最大的免疫反应，绝对不能让免疫动物对抗原产生‘自体识别’。例如，要想生成抗人体蛋白的抗体，使用兔或老鼠比使用猴子要好。对于非常保守的哺乳动物蛋白，使用鸟类动物（如鸡）效果较好。 4.2 动物免疫 我们通常使用弗氏佐剂（Freunds）与抗原进行混合。第一次注射完全使用Freunds的免疫辅助剂。辅助剂与抗原联合使用，可以提高免疫反应，从而用较少的疫苗可以产生较强的免疫反应。佐剂可以使抗原缓慢释放，从而产生持续性刺激。注射方式为多位点的皮下注射。每只注射动物都要先收集免疫前血样，以用于和以后的免疫血样比较。所采集的血清样本含有不同的免疫型和亚型。 备注 4.3 抗多肽血清的制备（SOP） 一、材料(带√项目见附录1) 1、家兔：健康雄性家兔。至少准备2只家兔，以防一只家兔死亡或者免疫接种失败。 2、肽一载体：上海强耀生物，规格2.5mg肽/瓶。 3、PBS，(0.01mo1/L、 pH7.4) 4、弗氏完全佐剂（FCA）(sigma) 5、弗氏不完全佐剂（FICA）(sigma) 6、免疫抗原的制备 取2.5mg肽- KLH溶解到2.5ml的PBS中，然后加入等体积的弗氏完全佐剂混合乳化（采用双头抽吸装置乳化）。每只家兔接种混合物2.5mL。 如果是用弗氏不完全佐剂时，将上述“弗氏完全佐剂”替换为“弗氏不完全佐剂”。 9月10日 21-28 采集血清 4 8月21日 21-28 脊柱两侧（2-4点）和腹股沟部（2-4点）多点皮内和臀部肌肉注射（2点） 总量2.5ml,每点约0.2-0.4ml FICA 3 7月30日 14-