[医药卫生]杂交组化2010.ppt

Chapter 4Hybridohistochemistry In situ hybridization，ISH 徐州医学院病理学教研室 周士东 2010.01.16. nucleic acid hybridization 液相杂交 固相杂交 ISH 结果显示 In situ hybridization ISH 的基本概念 根据核酸分子间碱基互补的性质 结合组织化学和免疫组织化学技术 在组织切片或细胞片上原位反应显示特异核酸顺序 nucleotide or DNA nucleotide sequence double stranded DNA dsDNA dsDNA 第一节 ISH技术的建立和发展 原位杂交技术建立(1969) 同位素标记探针(1970) 荧光素标记探针(1981) 酶标记探针(1982) 生物素标记探针(1983) 地高辛标记探针(1987) 原位分子杂交技术建立 1969年，美国耶鲁大学Call和Pardue用爪蟾核糖体基因探针与其卵细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中，建立原位分子杂交技术。 同位素标记探针 1970年，Orth用3H标记兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤病毒组织的冰冻切片原位杂交检测病毒DNA。 荧光素标记探针 1981年，Bauman等用荧光素标记cRNA探针原位杂交，用荧光显微镜观察结果。 酶标记探针 1982年，Shroyer用2,4二硝基苯甲醛（ DNP ）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，用兔抗DNP的酶标抗体识别杂交后的探针，再经免疫过氧化物酶组化方法显示杂交信号。 生物素标记探针 1983年，Brigat等应用生物素标记探针在组织切片上检测病毒DNA，杂交后用免疫组织化学方法显示病毒DNA在细胞中的定位。 地高辛标记探针 1987年，Boehringer Mannheim Biochemisca将地高辛标记探针的有关检测试剂盒投放市场。地高辛标记探针安全、方便、省时，敏感性高，质量控制好，既克服了生物素标记敏感性不足的缺点，又避免了放射性同位素标记的污染。 ISH的原理 ①变性 加热或用变性剂使氢键断裂，双链DNA解离为单链DNA 。 ②复性或退火 互补单链DNA又回复双链状态。 ③杂交 在复性或退火过程中加入探针与互补待测DNA的单链碱基配对形成核酸双链分子。 ④显示 杂交后以感光或化学反应显示与探针互补的靶核酸（DNA或RNA）。 DNA变性示意图 杂交组织化学成功的4个方面 ① 探针 特异性强，长度适中，标记良好。 ② 标本 组织结构保存完好。 ③ 操作 试剂可靠，方法正确。 ④ 知识 熟悉形态学（如细胞生物学、组织胚胎学、病理解剖学）。 原位杂交操作流程 标本准备 杂交过程 第二节 探针的类型、特性及优、缺点 Probe——标记的已知序列的核苷酸片段 类型 —— double stranded DNA probes single stranded cDNA probes single stranded cRNA probes oligonucleotide probes —— 放射性或非放射性标记 探针的类型、特性及优、缺点 探针标记物 探针标记物特点 DNA探针制备基本步骤 ? 酶切、重组：获取DNA片段，用连接酶整合入载体形成重组质粒（如pBR322） ? 转化、扩增：重组质粒转化入细菌内克隆后培养扩增 ? 分离、纯化：酶切质粒中 DNA序列 ，纯化非标记探针 DNA探针的特点 ①制备简单，使用方便。克隆后扩增和标记获得大量标记探针（需PCR仪，费用高）。DNase活性容易消除， DNA探针敏感性较好。 ②双链探针，变性使用。 dsDNA与切片靶DNA一起变性（M13制备单链cDNA探针，操作难，费用高）。 RNA探针的特点 ①分子小(单链)，透性好，全部配对杂交（杂交后能用RNA酶处理非特异性RNA探针，减少背景）。 ②转录和标记一步制备RNA探针（将 cDNA整合入带RNA多聚酶启动子的质粒，转化细菌后扩增， 提取质粒，在体外合成RNA探针，同时标记）。 寡核苷酸探针的特点 透性好（长度30～150bp），产量高（DNA合成仪合成单链DNA寡核苷酸）。 敏感性低（末端标记法标记探针）， 费用高 。 第三节 原位杂交主要的实验程序 ? 杂交前准备（initial priparation） ? 预处理（pretreatment） ? 变性和杂交（denaturation hybridization） ? 杂交后清洗（post-hybridizaton） ? 杂交体的检测（detection） 杂交前准备 从石蜡